מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הליך הנתיחה, מצב התרבית וההדמיה החיה של מערכת אקספלנט של אנטנות-מוח לצורך חקר מכלול מעגלי חוש הריח.
Abstract
~נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקור את התהליך הזה מכיוון ש-50 סוגים של נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs) מהאנטנות והפלפים המקסילריים מקרינים את האקסונים שלהם ל-50 גלומרולי הניתנים לזיהוי באונה האנטנה ויוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs). מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בזיהוי מולקולות חשובות המווסתות את המיקוד המדויק במעגל חוש הריח באמצעות רקמות קבועות. כאן מתוארת מערכת הסברים של אנטנה-מוח המשחזרת אבני דרך התפתחותיות מרכזיות של הרכבת מעגלי חוש הריח בתרבית. באמצעות ניתוח הקוטיקולה החיצונית וניקוי גופי שומן אטומים המכסים את המוח הפופל המתפתח, ניתן לאסוף תמונות באיכות גבוהה של נוירונים בודדים ממוחות חיים באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. זה מאפשר הדמיה בהילוך מהיר של מיקוד אקסון ORN יחיד מרקמה חיה. גישה זו תסייע לחשוף הקשרים ותפקודים ביולוגיים חשובים של תאים של גנים חשובים שזוהו בעבר ולזהות מנגנונים העומדים בבסיס התהליך הדינמי של הרכבת מעגלים.
Introduction
נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. במשך יותר מ-100 שנה, מדעני מוח מנסים להבין כיצד נויריטים מתרחבים לעבר המטרות הבינוניות והסופיות שלהם בדיוק רב. כתוצאה מכך, הם זיהו גנים חשובים המקודדים רמזי הנחיה לפיתוח תהליכים עצביים1. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקר התהליך הזה, שכן נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs, הנוירונים החושיים העיקריים) מקרינים 50 גלומרולי הניתנים לזיהוי עם גודל, צורה ומיקום יחסי סטריאוטיפיים, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs), שכל אחד מהם שולח דנדריטים לאחד מ-50 הגלומרולי2 (איור 1A ). לכן, קל יחסית לזהות פנוטיפים מוטנטיים ברזולוציה סינפטית (גלומרולרית) במערכת חוש הריח הזבובית. זה הוביל לתגליות של גנים חשובים המווסתים את הרכבת מעגלי חוש הריח3.
ההרכבה של מעגל חוש הריח הזבובי מסתמכת על תהליכים התפתחותיים מתואמים זמנית ומרחבית3. ORNs ו- PNs רוכשים גורלות תאים מובחנים, אשר מגדירים את התוכנית עבור ספציפיות החיווט שלהם. לאחר מכן, דנדריטים של PN מקדימים את אונת האנטנה (איור 1B). לאחר מכן, האקסונים של ה-ORNs מקיפים את אונת האנטנה האיפסילטרלית וחוצים את קו האמצע של המוח כדי להגיע לאונת האנטנה הקונטרה-צדדית. לאחר מכן, אקסונים של ORN פולשים הן לאונות אנטנה ipsi והן לאונות אנטנה קונטרלטרליות ויוצרים סינפסות עם דנדריטים של PNs השותפים שלהם בגלומרולי ספציפי. מודל גס זה להרכבת מעגלי חוש הריח הוצע על סמך אפיון דגימות קבועות מנקודות זמן ביניים במהלך הפיתוח. הרזולוציה הטמפורלית הירודה וחוסר היכולת לעקוב אחר אותם תהליכים עצביים לאורך ההתפתחות מרקמה קבועה מגבילים את ההבנה המכניסטית של תהליך הרכבת המעגלים.
זה מאתגר מבחינה טכנית לצלם בשידור חי תהליכי ORN ו- PN in vivo מכיוון שתהליך החיווט מתרחש במחצית הראשונה של שלב הפופל כאשר אונת האנטנה מוקפת בגוף שומן אטום בתוך מארז הפופל. לכן, אי אפשר לדמות ישירות את מעגל חוש הריח המתפתח מגלמים שלמים. רקמות מנותחות בתרבית ex vivo יכולות לעקוף את אטימות הרקמות ושימשו בהצלחה לחקר ההתפתחות העצבית 4,5,6. האתגר של שימוש באסטרטגיה דומה של תרבית ex vivo explant כדי לחקור חיווט עצבי במוח הפופל הוא האם הוא משחזר את מיקוד הנוירונים המדויק במצב תרבית. בהתבסס על מצב תרבית ex vivo שדווח בעבר עבור קומפלקס העין-מוח זבוב7, פותח לאחרונה אקספלנט המכיל את כל המוח הפופלי, האנטנות ועצבי האנטנה המחברים ללא פגע, אשר שומר על מיקוד מדויק של מעגל חוש הריח וניתן להכפיף אותו להדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים למשך עד 24 שעות בתדר של כל 20 דקות8 . כאן מתואר פרוטוקול מפורט של תרבות ההסבר וההדמיה. מערכת ההסבר מספקת שיטה רבת עוצמה לחקר הרכבה של מעגלי חוש הריח ואולי גם מעגלים אחרים במוח המרכזי.
Protocol
Representative Results
Discussion
האקספלנט המוחי של אנטנות Drosophila שומר על מיקוד תקין של מעגל חוש הריח. שמנו לב שההתפתחות איטית פי 2 ב-ex vivo בהשוואה ל-in vivo. צוין כי מערכת ההסבר אינה שומרת על מישוש מקסילרי, המארח שישה סוגים של ORNs. כדי להבטיח שהתפתחות תקינה תחזור על עצמה ex vivo, יש להימנע ממתיחה של עצבי האנטנה במהל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לנ ‘אוזל ור’ היסינגר על עצתם לגבי תרבות ההסבר; מ. וגנר על העזרה הטכנית של המיקרוסקופיה הדו-פוטונית; D.J. Luginbuhl ליצירת זבובים מהונדסים; ד. פרידמן להצעות לניתוח תוכנה של פיג’י; י. גה לסיוע בעבודה בטיסה; ק. מקלפלין וק.ק.ל. וונג להערות על כתב היד. ל.ל. הוא חוקר במכון הרפואי ע”ש הווארד יוז. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות 1K99DC01883001 (ל- T.L.) ו- R01-DC005982 (ל- L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Génétique. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Génétique. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
