Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Staaffotoreceptorcellen, strak verpakt in de buitenste laag van het neurale netvlies, zijn een integraal onderdeel van het zicht op zwak licht. Om te functioneren als getrouwe fotonentellers, gebruiken staafjes een op G-eiwit gebaseerde signaalroute, fototransductie genaamd, om snelle, versterkte en reproduceerbare reacties op het vastleggen van enkele fotonen te genereren. Deze reactie op licht veroorzaakt uiteindelijk een verandering in de stroom bij het plasmamembraan en wordt vervolgens gesignaleerd aan de rest van het visuele ^systeem1. Zoals hun naam al aangeeft, heeft elke staafcel een verschillende staafachtige vorm en vertoont een sterk gepolariseerde cellulaire morfologie, bestaande uit een buitenste segment (OS), binnensegment (IS), cellichaam (CB) en synaptische terminal (ST). Elk subcellulair compartiment heeft specifieke eiwitmachines (membraangebonden en oplosbaar), biomoleculaire kenmerken en eiwitcomplexen die een cruciale rol spelen, zoals visuele fototransductie, algemene huishouding en eiwitsynthese, en synaptische ^{transmissie2,3}.

Meer dan 30 jaar geleden werd de lichtafhankelijke wederzijdse beweging van subcellulaire eiwitten, met name transducine (weg van het OS) en arrestine (naar het OS), voor het eerst waargenomen4,5,6,7. Al vroeg werd dit waargenomen fenomeen met scepsis ontvangen, deels vanwege de kwetsbaarheid van immunohistochemie voor epitoopmaskering8. In de vroege jaren 2000 werd stimulusafhankelijke eiwittranslocatie bevestigd met behulp van een rigoureuze en zware fysieke ^{sectietechniek9}. Seriële tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde knaagdier retinae gevolgd door immunoblotting onthulde dat transducine9,10, ^{arrestin11,12} en ^recoveryin13 allemaal subcellulaire herverdeling ondergaan als reactie op licht. Er wordt aangenomen dat lichtgestuurde translocatie van deze belangrijke signaaleiwitten niet alleen de gevoeligheid van de fototransductiecascade9,14,15 reguleert, maar ook neuroprotectief kan zijn tegen lichtschade16,17,18. Omdat lichtgedreven eiwittransport in staven zeer belangrijk lijkt te zijn voor de biologie en fysiologie van staafcellen, zijn technieken die de isolatie van verschillende subcellulaire compartimenten mogelijk maken om de eiwitverdeling te bepalen waardevolle onderzoeksinstrumenten.

Momenteel zijn er een paar methoden gericht op het isoleren van de staafsubcellulaire compartimenten. Deze methoden kunnen echter lang en moeilijk te reproduceren zijn, of vereisen een aanzienlijke hoeveelheid retinaal isolaat. Staaf buitensegment (ROS) preparaten via dichtheidsgradiënt ^{centrifugatie19} wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om de ROS te scheiden van retinaal homogenaat. Deze methode wordt veel gebruikt voor western blot, maar de procedure is zeer tijdrovend en vereist een minimum van 8-12 murine ^retinae20. Aan de andere kant is seriële tangentiële sectie van bevroren murine en rat retinae met succes geïmplementeerd bij het isoleren van het OS, IS, CB en ST9,11,13. Deze methode is echter technisch uitdagend vanwege de noodzaak om het kleine en sterk gebogen muriene netvlies volledig af te vlakken om de retinale lagen uit te lijnen voorafgaand aan tangentiële sectie. Aangezien er een overvloed aan muismodellen en transgene muizen zijn die ziekten van het visuele systeem samenvatten, is de creatie van een techniek die betrouwbaar, snel en gemakkelijk individuele staafcompartimenten scheidt veelbelovend bij het onthullen van de fysiologische processen die zich voordoen in elk gespecialiseerd compartiment en de mechanismen die ten grondslag liggen aan visuele processen in gezondheid en ziekte.

Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, beschrijven we twee peelingmethoden die staafsubcellulaire compartimenten gemakkelijker isoleren dan de huidige protocollen. De eerste peelingmethode, aangepast van een techniek om fluorescerend gelabelde bipolaire cellen bloot te leggen voor patchklemregistratie21, maakt gebruik van cellulosefilterpapier om de ROS sequentieel te verwijderen van een levend, geïsoleerd murine netvlies (figuur 1). De tweede methode, aangepast van een procedure die de drie primaire retinale cellagen isoleert van een ^chick22 en ^frog23 retina, maakt gebruik van plakband om het ROS- en staafbinnensegment (RIS) van een gelyofiliseerd netvlies te verwijderen (figuur 2). Beide procedures kunnen in 1 uur worden voltooid en zijn aanzienlijk gebruiksvriendelijk. We bieden validatie van de effectiviteit van deze twee scheidingsprotocollen voor western blot door gebruik te maken van donker-aangepast en aan licht blootgesteld netvlies van C57BL / 6J-muizen om lichtgeïnduceerde translocatie van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) aan te tonen. Bovendien leveren we met behulp van de tape peeling-methode aanvullend bewijs dat onze techniek kan worden gebruikt om inconsistenties tussen eiwitlokalisatiegegevens verkregen door immunocytochemie (ICC) en western blots te onderzoeken en aan te pakken. Concreet toonde onze techniek aan dat: 1) het eiwitkinase C-alfa (PKCα) isovorm niet alleen aanwezig is in bipolaire cellen, maar ook in murine ROS en RIS, zij het in lage ^{concentraties24,25}, en 2) rhodopsinekinase (GRK1) voornamelijk aanwezig is in het geïsoleerde OS-monster. Deze gegevens tonen de effectiviteit aan van onze twee peelingtechnieken voor het scheiden en kwantificeren van specifieke staaf- en retinale eiwitten.