JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

Published: September 20, 2021
doi:
10.3791/62968
, , ,
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes,Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Summary

Bu protokol, dna çift iplik kopmalarında transkripsiyonu tek molekül hassasiyetiyle tespit etmek için yeni bir muhabir gen sistemi ve deneysel kurulum sunar.

Abstract

DNA çift iplikçik kopları (DSB) en ciddi DNA hasarı türüdir. Genom bütünlüğü üzerindeki yıkıcı sonuçlara rağmen, DSB’lerin transkripsiyonu nasıl etkilediği şimdiye kadar zor olmaya devam ediyor. Bunun bir nedeni, transkripsiyonu aynı anda izlemek için uygun aletlerin bulunmaması ve yeterli zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip birjenik DSB’nin indüksiyonuydu. Bu çalışma, DNA şablonunda bir DSB’nin indüksiyonundan hemen sonra canlı hücrelerde transkripsiyonu doğrudan görselleştiren bir dizi yeni muhabiri açıklar. Bakteriyofaj RNA kök döngüleri transkripsiyonu tek molekül hassasiyeti ile izlemek için kullanılır. DSB’yi belirli bir gen bölgesine hedeflemek için, muhabir genleri, insan genomunda bulunmayan, homing endonuclease I-SceI’nin tek bir tanıma dizisini içerecek şekilde tasarlanmıştır. Her muhabir geninin tek bir kopyası insan hücre hatlarının genomuna entegre edildi. Bu deneysel sistem, kurallı gen transkripsiyonu veya DNA kırılma kaynaklı transkripsiyon başlatma ile oluşturulan tek RNA moleküllerinin tespitini sağlar. Bu muhabirler, transkripsiyon ve DNA hasarı arasındaki karşılıklı etkileşimleri yorumlamak ve DNA kırılmasına bağlı transkripsiyonun takdir edilmeyen yönlerini açıklamak için eşi görülmemiş bir fırsat sağlar.

Introduction

DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler), hücre fonksiyonlarını bozan ve çeşitli hastalıkların ve yaşlanmanın isyanına katkıda bulunan toksik DNA lezyonlarıdır1. DSB’lerin yanlış onarımından kaynaklanan mutasyonlar gen ekspresyonını etkiler ve hücrenin fonksiyonel düşüşüne zemin hazırlar. DSB’lerin lezyon alanında de novo break-indüklenen transkripsiyonu kullandığına dair ortaya çıkan görüş2,3,4,5,6,7, DSB’lerin kırılma kaynaklı RNA’lar yoluyla hücresel fonksiyonu da etkileyebileceğini göstermektedir. Son zamanlarda yapılan birkaç çalışma, DSB’lerin programlanmış (örneğin, uyaran indüklenebilir genlerde) ve programlanmamış (örneğin, kurallı olmayan promotörlerde) transkripsiyonunu başlatmak için yeterli olduğunu göstermektedir4,5,7. Bununla birlikte, DNA hasarı ve transkripsiyon arasındaki bağlantıları araştıran çeşitli çalışmalara rağmen, alan hala DNA kırılma bölgelerindeki transkripsiyon olaylarının kesin (yani tek moleküllü) bir nitelemesi sunma kapasitesinde gecikendir. Bunun önemli bir nedeni uygun deneysel aletlerin olmamasıydı. Hücre ışınlama (γ ışınları, röntgenler, ağır iyonlar) ve ilaç tedavileri (örneğin, topoisomeraz inhibitörleri veya interkalansyon ajanları) mekansal hassasiyetten yoksundur ve tek iplik kopmaları ve DNA ekucts8 dahil olmak üzere DSB’ler dışındaki DNA lezyonlarına neden olur. I-PpoI ve AsiSI gibi endonülozlar lokusa özgü DSB’ler oluşturur, ancak yüksek zamansal hassasiyete sahip tek bir lokumda transkripsiyonun eşzamanlı canlı hücre görselleştirilmesine izin veren bir sistemle birleştirilmemiştir8. Bu sınırlamayı atlamak için laboratuvarımız, benzersiz bir DSB4’ün kontrollü indüksiyonu üzerine transkripsiyonu tek molekül çözünürlüğü ile doğrudan görselleştiren bir dizi son teknoloji muhabir geliştirmeye öncülük etti. Burada, bu muhabirleri tarif ediyoruz, DSB’lerde transkripsiyonun canlı hücre görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve tek bir DSB’de transkripsiyon başlatmasını ortaya koyan verileri gösteriyoruz.

Bu protokolde kullanılan muhabir gen sistemleri iyi karakterize fare IgM muhabir genine dayanır ve IgM’nin membran bağlı formunun (μm) M1 ve M2 eksonlarını içerir μ ağır zincir9,10,11. Hibrit bir intron, iki eksonu güçlü adenovirüs majör geç transkript (AdML) PY kanalı ile ayırır12. Muhabir genlerinin ekspresyonu, Tet operatörü (TetO) dizisinin iki tandem kopyasının yerleştirildiği insan sitomegalovirüs promotörü (CMV) tarafından kontrol edilir. Muhabir genlerinin her biri Flp Rekombinasyon Hedefi (FRT) bölgesi içeren bir plazmid vektöre yerleştirilir ve hek293 konak hücre hattının genomunda belirli bir FRT hedef bölgesine yerleştirilir. Bu hücre hattı ayrıca tetrasiklin/doksiksin varlığı veya yokluğu yoluyla muhabir geninin ekspresyonunun düzenlenmesi için Tet represör proteinini de tam olarak ifade eder. Muhabir gen transkripsiyonunun görselleştirilmesine olanak sağlamak için, transkript başlangıç bölgesi ve muhabir geninin ekson/intron yapısı açısından farklı pozisyonlara MS2 kök döngü dizisinin 24 tandem tekrarı ve PP7 kök döngü dizisinin 24 tandem tekrarı yerleştirildi. MS2/PP7 RNA kök döngüleri transkripsiyon üzerine oluşur ve özellikle yeşil ve kırmızı floresan proteinlerle etiketlenmiş ektopik olarak ifade edilen MS2/PP7 kat proteinleri ile bağlanır, bu strateji daha önce görüntü transkripsiyonu için yaygın olarak kullanılır13,14,15. Buna ek olarak, muhabir genlerindeki RNA kök döngü dizisi dizileri tarafından doğrudan kuşatılan homing endonuclease I-SceI için 18 bp tanıma dizisinin tek bir kopyası eklenmiştir. Tüm plazmidleri üretmek için standart klonlama teknikleri kullanıldı, PROP muhabir geninin I-SceI-24xMS2 kök döngüsünü içeren parça ticari bir gen sentezleme hizmeti ile sentezlendi.

Promotör-proksimal DSB muhabir geni (PROP), ekson I’deki putatif transkripsiyon başlangıç bölgesinin I-SceI kesme sahası 45 baz çifti (bp) aşağı akışına yerleştirilerek inşa edildi, ardından iki alternatif aynı olmayan kök döngü dizisiyle tasarlanan 24x MS2 kök döngü kasetinin başlangıcına kadar 149 bp takip edildi16 ve artıklığı azaltmak için tekrarlanmayan beş 20 bp aralayıcı dizisi. MS2 kök döngü dizisi, 1844 bp intron başlangıcına kadar 72 bp ve bölünme ve poliadenilasyon bölgesine kadar 1085 bp exon II tarafından takip edilir. Ekson II, muhabir gen ekspresyonunun bağımsız bir şekilde taranmasını sağlamak için insan peroksisomal acil CoA oksidazından C-terminal peroksizomal hedefleme dizisine (PTS) kaynaşmış bir siyan floresan proteini (CFP) kodlar (Şekil 1A).

Exon II DSB muhabir geni (EX2), CFP-PTS’yi kodlayan intron ve exon II’yi takip ettiğim 167 bp’lik bir eksondan oluşur. 169 bp mesafede daha aşağı akışta, 24x MS2 kök döngüleri içeren bir kaset, ardından merkezde bir I-SceI sitesine sahip 84 bp bağlayıcı dizisi, ardından dekolte ve poliadenilasyon bölgesine kadar 24x PP7 kök döngüleri ve 221 bp (Şekil 1B) eklendi.

Son olarak, antisense transkripsiyon etiketlemeli exon II DSB muhabir geni (EX2AS), insan her yerde bulunan B (UBB) gen transkript UBB-201’e dayanmaktadır ve iki ekson ve bir intron içerir. Exon Ben 24x MS2 kök döngü dizisinin ters ekleme ile toplam uzunluğu 1534 bp var. Bu nedenle, doğru MS2 kök döngü RNA dizisi, CMV promotöründen muhabir geninin duyu transkripsiyonunun yanı sıra bir antisense yönünde yazılacaktır. İntron 490 bp uzunluğa sahiptir, ardından I-SceI sitesi ile exon II ve iki çerçeve içi ubiquitin alt birliği için bir kodlama bölgesi eklenmiştir. UBB geninin aşağı akışı, muhabir geninin bir anlamda transkripsiyonu üzerine 24x PP7 kök döngü oluşturan bir dizidir (Şekil 1C).

Homing endonuclease I-SceI’nin indüklenen bir yapının geçici transfeksiyon, her muhabir geni18 içinde eklenen tanıma yerinde kontrollü bir DSB oluşturulmasını sağlar. I-SceI endonucleaz, glukokortikoid reseptörün ligand bağlayıcı etki alanı ve uzak kırmızı floresan protein iRFP713 ile çerçeve içinde kaynaşmıştır. Bu yapı triamsinolon asetonid (TA) yokluğunda sitoplazmiktir, ancak TA’nın hücrelerin büyüme ortamına eklenmesiyle hızla çekirdeğe göç eder (Şekil 1D). DSB’lerin I-SceI sistemi tarafından indüksiyonu, 18,19,20’den önce gösterildiği gibi sağlamdır. Muhabir gen transkripsiyonu, floresan etiketli RNA kök döngü sistemleri MS2 ve PP7 görselleştirilerek paralel olarak izlenebilir.

Protocol

1. Canlı hücreli mikroskopi için hücrelerin hazırlanması ve transfeksiyon Canlı hücre mikroskopisi deneyinden bir gün önce -90 izdiah elde etmek için 5 mL DMEM ile muhabir hücre hattının (EX2, EX2-AS veya PROM) 25 cm2 hücre kültürü şişesini hazırlayın. Ortamı 25 cm2 hücre kültürü şişesinden bir pipetle epire edin ve hücreleri 2,5 mL 1x PBS ile yıkayın. 1 mL tripsin-EDTA (%0,05) ekleyin ve hücre müfrezesi için 2-3 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Hücre müfrezesi sonrası HEPES tamponu içeren fenol kırmızısı içermeyen, (v/v) kömürle soyulmuş fetal sığır serumu ile desteklenmiş 4 mL DMEM ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden biriktirin. 10 mm cam tabanlı kuyulu (çap No. 1,5) ve homojenize 35 mm yuvarlak bir tabakta hücre çözeltisinin plaka 1 mL’si. 35 mm yuvarlak tabağı 100 mm standart hücre kültürü kabının içinde saklayın ve %5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 °C’de kuluçkaya yatırın. ~6 h tohumlamadan sonra, cam alt tabaktaki hücreleri transfect. Her transfeksiyon karışımı için aşağıdaki şekilde iki çözelti hazırlayın: 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde, 150 μL azaltılmış serum minimal esansiyel ortam (MEM), plazmid DNA ( Tablo 1’de açıklandığı gibi) ve transfeksiyon yardımcı reaktifinin 2,5 μg/μL DNA’sını içeren A çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Buna paralel olarak, lipid bazlı transfeksiyon reaktifinin 150 μL azaltılmış serum MEM’i ve 1,5 μg/μL DNA’sını içeren B çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Her iki çözeltiyi de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatır. Ardından, B çözümüne A çözümünü yavaşça ekleyin ve RT’de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri transfect etmek için, her yemeğe 300 μL çözelti A + B damla yönünde ekleyin ve yavaşça dağıtın. Cam alt kabı 100 mm standart hücre kültürü kabının içinde saklayın ve % 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 °C’de kuluçkaya yatırın. (v/v) kömürle soyulmuş fetal sığır serumu ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan HEPES’li 200 μL DMEM’li 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve TA’yı 7,5 x 10-7 M konsantrasyona ekleyin. 2. Deneysel kurulum Ortak kontrol ünitesinde büyük pleksiglas mikroskop inkübasyon odasının ve üst aşama inkübasyon odasının sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın. Sahne inkübasyon odasının içindeki çevresel koşulları %5 CO2 ve 0 neme ayarlayın.NOT: Mikroskop kafesi ve sahne inkübatörü sıcaklığı, sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için komple sistemin ısıtılmasını sağlamak için deneye başlamadan önce en az 1 saat ayarlanmalıdır. Diğer tüm mikroskop kontrol ve işletim ünitelerini aynı anda başlatın. Büyüme ortamına doksiksin (0,5 μg/mL) ekleyerek muhabir genlerinin transkripsiyonunu teşvik edin ve mikroskopi gözlemine başlamadan önce 200 μL mikropipette ~1 saat ile yukarı ve aşağı pipetleme ile hafifçe karıştırın.NOT: Cam tabanlı kabı transfected hücrelerle birlikte tutun, sıcaklığı mümkün olduğunca sabit tutmak için hücre kültüründen mikroskop odasına bir strafor kabında kolay kullanım ve taşıma için 100 mm standart hücre kültürü çanağının içindedir. Gözleme başlamadan önce hücreleri mikroskopa en az 30 dakika taşıyın ve varışta, 100 mm’lik kabı hücrelerle birlikte önceden ısıtılmış büyük mikroskop inkübasyon odasının içine yerleştirin. Mikrosantrifüj tüpünü adım 1.7’den itibaren önceden seyreltilmiş TA ile yerleştirin. 37 °C’ye kadar ısınmak için büyük mikroskop çevre odasının içinde. Daha önce hazırlanana benzer cam alt kabın kapağını kapağına delinmiş 3 mm çapında bir delik ile değiştirin (Şekil 2A).NOT: TA daha sonra mikroskop aşamasına monte edilen kabı manipüle etmeden kapaktaki küçük delikten hücrelere eklenecektir. Mikroskop kontrol panelinde 100x (apochromatic objective, 1.4 numerical aperture) yağ daldırma hedefini seçin. Hedefe bir damla daldırma yağı uygulayın. Cam tabanlı kabı mikroskop aşaması inkübasyon odasının içindeki hücrelerle ayarlayın ve yerine kilitleyin. Sahne inkübatörünün kapağını ve mikroskop muhafazasının tüm kapılarını kapatın. Mikroskop işletim ve kontrol yazılımını başlatın, Odak Kontrolü penceresini açın (Şekil 2B), Kapsam bölmesine tıklayın ve Emisyon Seçimi bölmesinde, göz tarafından doğrudan örnek gözlem için oküler ışın yolunu ayarlamak için % 100 Göz kutusunu tıklatın. Filtre Kümesi menüsünde Göz filtresi kümesine geçin ve Brightfield’ı tıklatın ve Brightfield’ı Aç düğmesine basın. Yağ cama temas edene kadar mikroskop hedefini cam alt kabına doğru hareket ettirin. Sonra okülerlere bakın ve hücrelerin düzlemine manuel olarak odaklanın. Brightfield’ı Aç düğmesini kapatın. Çevresel koşullara uyum sağlamak ve sıcaklık gradyanları tarafından görüntüleme sırasında odak sürüklenmesini önlemek için deneysel gözlemlere başlamadan önce hücreleri 30 dakika bekletin. Oda sıcaklığında bir kenara kullanıma hazır 200 μL mikropipette ve 200 μL filtre uçları yerleştirin. 3. Görüntü alımı Mikroskop kontrol yazılımının Odak Kontrolü penceresinde lazer yoğunluğunu %5 olarak ayarlayın ve pozlama süresi için 50 ms değer girin (Şekil 2B). Üç boyutlu (3D) zaman atlamalarının otomatik görüntü alımını gerçekleştirmek için ayarları yapmak üzere Yakalama penceresini açın (Şekil 2C). 3B yakalama alım türünü seçin ve 0,4 μm ile ayrılmış 12 ila 16 optik dilim ayarlayın, akımın etrafındaki Aralık onay kutularını işaretleyin ve yakalandıktan sonra geçerli konumuna dönün. Zaman Yakalama bölmesinde, zaman noktası sayısı için 120 ve aralık için 30 s değerini girin. GFP için φ = 488 nm, TagRFPt için φ = 561 nm ve iRFP713 için φ = 640 nm olan transfected floresan protein etiketlerine göre konfokal filtre kümesini seçin ve her kanal için pozlama süresini 50 ms olarak ayarlayın. Odak Penceresinde seçilen %5 değerini kullanmak için Lazer gücü için Akım ayarını kullanın (Şekil 2C). Odak Kontrolü penceresinde, Kamera bölmesine gidin, Görüntü görüntüleme denetimini ölçeklendir’i seçin ve görüntülenecek sabit bir görüntü yoğunluğu aralığı ayarlamak için El ile düğmesini seçin. Düşük: 500 ve Yüksek: 5000 değerlerini girin (bkz. Şekil 2B).NOT: Bu ayar, aynı floresan yoğunluğu aralığındaki hücreleri seçmek için canlı görüntüde görüntülenen kamera çekiminin dinamik aralığını sınırlar (Şekil 2D). DSB indüksiyonu üzerine transkripsiyon sitelerinin 3B zaman atlamalı görüntülenmesi için hücreleri seçin. Hücreleri tarayın ve Tartışma’da açıklanan koşullara göre üç görünüm alanı seçin. Daha önce görüş alanının ortasında bulunan seçilen her hücreyi, Z yığınının orta düzleminde transkripsiyon sitesiyle odakla.NOT: Hücrenin ve transkripsiyon bölgesinin XYZ’de ortalanması, hücrenin bir miktar hareketini karşılar. Odak Denetimi penceresinin XY bölmesindeki her XYZ konumunu, Noktayı Ayarla’yı tıklatarak işaretleyin.NOT: Muhabir genlerinin sürekli transkripsiyonunu ve hücrelerin XYZ boyutlarındaki konumlarının göreceli konumsal kararlılığını doğrulamak için seçilen pozisyonları aşağıdaki 5 dakika boyunca 2-3 kez yeniden ziyaret edin. Adım 1.7’den itibaren önceden seyreltilmiş TA’nın 200 μL’lik kısmını ekleyin. Şekil 2F’de gösterildiği gibi hücrelere.NOT: İşaretli XY konumlarından herhangi bir kaymayı önlemek için TA’yı eklerken cam tabanlı kaba veya kapaklara dokunmamaya çok dikkat edin. DSB indüksiyondan sonra, hücrelerin görüş alanı içinde ortalanmış olduğunu ve transkripsiyon bölgesinin merkez Z düzleminde olduğunu onaylayın. Yeniden odaklama ve konum güncellemesi 1-2 dakikadan fazla sürmemelidir. Yakalama penceresinde Başlat’a tıklayarak 3D zaman serisi görüntülemeyi başlatın . Görüntüleme verilerini mikroskop kontrol bilgisayarı sabit sürücüsündeki mikroskop kontrol yazılımı veri biçiminde kaydedin. 4. Veri analizi Mikroskop kontrol yazılımındaki görüntüleme verilerini açın ve 16 bit TIFF biçiminde dosyalar olarak dışa aktarın. Dışa aktarılan dosyaları StaQtool21 yazılımıyla açın. Tek Nokta 3D modunu seçin ve Git’e basarak görüntü dosyalarını yükleyin.NOT: Seçilen zaman serisi, ilk zaman noktasının z yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonu gösteren Maksimum Projeksiyon Zaman Gölgesi Görüntüleyicisi’nde açılır (Şekil 3A). Sol taraftaki dikey MAX kaydırıcısıyla görüntü yoğunluğu ekranını ayarlayın. Yatay Zaman Noktası kaydırıcısıyla çözümlemek için zaman noktasını seçin. İmleci el ile işaretlemek için etiketli transkripsiyon sitesinin konumuna getirin veya Otomatik algıla işlevini kullanın ve birkaç nesne algılanırsa ilgili transkripsiyon sitesine basın. Zaman içinde transkripsiyon sitesinin XYZ konumlarını belirlemek için Otomatik İzleme işlevini kullanın.NOT: Belirli bir konum doğru şekilde izlenmediyse, StaQtool yazılım kılavuzuna göre transkripsiyon sitesini manuel olarak seçin. Gauss’un her zaman noktasına uyum sağlamak ve toplam floresan yoğunluğunu (TFI) ölçmek için Otomatik düğmesine basın.NOT: Transkripsiyon etkinliği durursa, izleme aracı kırınım sınırlı bir nesnenin (etiketli bir transkripsiyon sitesi) algılandığı son konumda kalır. Transkripsiyon sitesi etiketi kaybolduktan sonra hücre XY yönünde hareket ederse, arama karesinin el ile yeniden konumlandırılması gerekir. Her zaman noktası için TFI değer uydurmasını bitirdikten sonra, geçerli zaman serisi görüntü dosyasını kapatmak ve bir sonraki dosyaya devam etmek için Zaman sonunu sonlandır düğmesine basın.NOT: TFI değerleri otomatik olarak dışa aktarılır ve bir Excel dosyasına kaydedilir. 5. Mikroskopi kalibrasyon ölçümleri ve analizi 35 mm cam tabanlı yemeklere tohum hücreleri ve Bölüm 1’de açıklandığı gibi floresan etiketli MS2 ve PP7 kat proteinleri ile transfect.NOT: Kalibrasyon ölçümleri için Giriş bölümünde açıklanan muhabir gen hücresi çizgilerinin aynısını kullanın. Mikroskopi görüntü alımına başlamadan önce hücrelerin büyüme ortamına 1 saat 0,5 μg/mL doksiklin ekleyin. Cam alt kabı mikroskop aşaması inkübasyon odasının içine monte edin ve görüntü alımını daha önce olduğu gibi hazırlayın (bkz. Bölüm 2).NOT: Cam alt kabın orijinal kapağı kalibrasyon deneyleri için değiştirilmez. 3.1 noktasında açıklandığı gibi aynı Lazer yoğunluğu ve pozlama ayarlarını kullanın. 2D zaman serisi için Yakalama ayarlarını ayarlayın ( Yakalama Türü bölmesindeki 3D seçeneğinin seçimini kaldırın) ve Timelapse Capture panelinde (Şekil 2C) 500 ms aralıklarla 120 zaman noktası ayarlayın.NOT: Bu görüntü alma ayarı, çok kısa aralıklarla tek bir optik düzlem içinde zaman serilerine neden olur. Birkaç yüz tek transkript TFI ölçümünü saymak için veri kümeleri oluşturmak için birden fazla konumdan düzinelerce kalibrasyon süresi serisi elde edin. Kalibrasyon zaman serisinin analizi için, dosyaları 4.1 noktasına göre 16 bit TIFF biçimindeki dosyalara dönüştürün. Dışa aktarılan dosyaları StaQtool21 yazılımıyla açın (Şekil 3). LOG dosyasını seç düğmesine basın, 4.2 noktasında açıklandığı gibi alınan ilgili 2D zaman serisinin Günlük Dosyasını seçin. Birden Çok Nokta 2D onay kutusunu seçin ve zaman serisini analiz yazılımına yüklemek için GO düğmesine basın. Zaman çakışması görüntüleyici penceresinde (Şekil 3A), PSF FWHM’de, giriş alanı mikroskop sistemi için hesaplanan değeri ve açıklandığı gibi hedefi ekler21. Çözümleme işlemini başlatmak için, görüntülenen geçerli zaman noktası için kırınım sınırlı tüm nesneleri algılamak üzere Otomatik Algıla düğmesine basın. Ardından, her nesnenin TFI değerini belirlemek üzere Gauss Fitting’i gerçekleştirmek için AutoFit’e tıklayın (Şekil 3A). Alternatif olarak, imleci kırınım sınırlı bir nesnenin üzerine gelin ve seçmek için tıklatın (beyaz bir kare içindeki yeşil daire görünür) ve manuel seçim ve Gauss montaj prosedürü için Gauss Fit düğmesine basın.NOT: Son mod, aynı çekirdekte bulunan birkaç nascent transkriptine sahip parlak transkripsiyon siteleri gibi saymayan nesneleri hariç tutmanız önerilir. Önceki adımı tamamlamak için Timelapse’i sonlandır düğmesine basın.NOT: Sonuçlar otomatik olarak görüntü dosyasıyla aynı klasörde bir Microsoft Excel dosya biçiminde kaydedilir. İlgili düğmeye basarak birden fazla nokta için TFI ve W Dağıtımları modülünü başlatın (Şekil 3B). Excel dosyalarını dosya ekle düğmesiyle yükleyin ve Git düğmesine basarak TFI analizini başlatın.NOT: Çıktı, birden fazla ölçülen tek transkript TFI’sinden belirlenen ortalama TFI değeridir. Daha önce 5.10 noktasında kullanılan PSF FWHM’yi takarak W analizini başlatın. ve Depo Gözü için varsayılan değeri kullanarak Git düğmesine basın.NOT: W parametresi, tek transkript TFI ölçümlerinin kullanılan mikroskop sistemi için doğru PSF FWHM değerine uyması için kalite kontrolüdür. 6. Veri ve kalibrasyon birleştirme 4,8 noktasında kaydedilen Excel sayfasından elde edilen zaman serisi TFI değerlerini girin. ve her zaman noktası değerini 5,15 noktasında elde edilen tek transkriptler için ortalama TFI’ye bölün.NOT: Bu işlemi standartlaştırmak için özel hazırlanmış Excel şablon formları kullanılmıştır.

Representative Results

Şekil 1A-C’de açıklanan muhabir genlerini barındıran hücre hatları, transkripsiyon dinamiklerinin canlı hücrelerde tek bir DSB’de incelenmesini sağlar. Şekil 1A-C’de her grafik muhabir gen gösteriminin altındaki sayılar kilobase çiftlerindeki uzunluğu gösterir (kbp). CMV sitomegalovirüs promotörünü gösterir, TetO Tet-operatör dizileridir, pA gen ucundaki 3′ dekolte ve poli-adenilasyon bölgesini vurgular. CFP-PTS, peroksizomal hedefleme sinyaline kaynaşmış kodlanmış siyan floresan proteindir ve 2UBB kodlanmış insan her yerde bulunan B tandem ünitesidir. Yukarıda açıklanan protokol ve analiz prosedürlerini izleyerek, floresan etiketli muhabir gen transkriptlerinin sayısını gösteren grafikleri, saatlere kadar olan sürelerde saniyeler içinde zamansal bir çözünürlükle elde etmek mümkündür (Şekil 4A-D). Şekil 4A’daki grafik, MS2-GFP moleküllerinin nascent transkriptlerinde birikmesiyle etiketlenmiş bir PROM muhabiri gen transkripsiyon sitesinin TFI değerlerinin zaman seyrini görüntüler. Bu belirli grafik, TA eklemesi olmayan bir denetim deneyini temsil eder; bu nedenle, hiçbir DSB indüklenen. Transkripsiyon, 60 dakikalık tüm gözlem süresi boyunca bir seferde patlama benzeri zirveler ve 2-8 transkript ile devam eder. EX2 ve EX2-AS muhabir genleri için de benzer sonuçlar elde edilmiştir (veriler burada gösterilmez)4. Muhabir genlerindeki tek bir DSB’nin indüksiyonu (I-SceI-GR-iRFP kullanılarak) DSB’nin devam eden muhabir gen transkripsiyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine ve DSB bölgesinden çıkan transkripsiyon olaylarının izlenmesine, yani kırılmaya bağlı transkripsiyona izin verir (Şekil 4B-D). DNA kırılmaya bağlı transkripsiyonun dinamikleri, DSB’nin gen içindeki konumuna bağlıdır.Muhabir geninde I-SceI-GR-iRFP tarafından tek bir DSB’nin promotör-proksimal I-SceI tanıma alanı ile indüksiyonu, TA ilavesi yaklaşık 11 dakika sonra muhabir geninin transkripsiyonal susturuşa yol açar ve transkripsiyon 60 dakikalık gözlem süresi içinde geri yüklenmez (Şekil 4B). EX2 muhabir gen transkripsiyonunu gözlemlerken, kurallı promotör güdümlü transkripsiyonun tam olarak baskılanması, TA ilavesi yaklaşık 30 dakika sonra hem MS2-GFP hem de PP7-RFP sinyallerinin aynı anda tamamen kaybedilmesiyle tespit edildi. Bununla birlikte, 10 dakika içinde, PP7-RFP floresan zirvelerinin yeniden görünmesiyle ortaya çıktığı gibi transkripsiyon yeniden başlar. PP7-RFP sinyalinin (MS2-GFP floresan değil) tamamen iyileşmesi kırılmaya bağlı transkripsiyon başlatmasını gösterir (Şekil 4C). Kırılmaya bağlı transkripsiyon uzun süreler boyunca stabil değildir; DSB sitesinden sadece birkaç kırılmaya bağlı transkript başlatıldığını gösteren patlama benzeri ve düşük tepe yoğunluğu görünür. Duyu transkripsiyonunu tespit etmek için I-SceI sitesinin exon II aşağı akışında 24x PP7 kök döngü dizisi içeren EX2AS muhabir geni, TA ilavesi sonrasında yaklaşık 25 dakika içinde EX2AS muhabir geni içinde kurallı promotör güdümlü transkripsiyonun sonlandırıldığını göstermektedir. Daha sonra, antisense MS2 kök döngü dizilerinden oluşturulan RNA’ya MS2-GFP protein bağlanmasının birikmesiyle ortaya çıkan antisense kırılma kaynaklı transkripsiyon ile değiştirilir (Şekil 4D). Antisense transkripsiyon aktivitesi, DSB’nin indüksiyonu nedeniyle duyu transkripsiyonunun kesilmesinden önce yoktu ve bu örnekte, mola alanından yaklaşık 15 dakika içinde birkaç transkript başlatıldığını göstermektedir. Burada elde edilen temsili veriler, DSB’lerin yakın zamanda bildirildiği gibi gen içindeki konumlarına bağlı olarak transkripsiyon üzerinde farklı etkileri olduğunu göstermektedir4. Veriler ayrıca, TA ilavesinden sonra 12 ila 30 dakika arasında değişen I-SceI-GR-iRFP tarafından DSB indüksiyonunun zamanlamasında bir hücreden hücreye değişkenliği ortaya koymaktadır. Ayrıca, bireysel transkriptlerin tespiti, hücreden hücreye hücre keşfine ve kırılmaya bağlı transkripsiyonal aktivitenin yoğunluğuna doğru site farklılıklarını kırmaya izin verir. Kırılmaya bağlı transkripsiyon sadece gen içindeki DSB’lerde tespit edilir. Kalan gözlem süresi boyunca kanonik transkripsiyonun bir DSB üzerinde sona erdiği promotör-proksimal DSB’lerde yoktur. Şekil 1: Muhabir genleri ve sistem DNA çift iplikçik kırılmalarına neden olmak için. (A) ila (C) arasında şematik temsil, DNA çift iplikçik kırılmasının indüksiyonu üzerine transkripsiyonu incelemek için kullanılan üç muhabir geninin yapısını gösterir. 24x MS2 kök döngü (MS2-SL) dizi dizisi tarafından aşağı doğru kuşatılan ilk eksonda (PROM) promotör-proksimal I-SceI bölgesine sahip muhabir geni (A) içinde tasvir edilir. İkinci eksonda (EX2) I-SceI bölgesine sahip muhabir geni, 24x MS2 kök döngü dizisi ile yukarı doğru ve aşağı akışta 24x PP7 kök döngü (PP7-SL) dizisi ile (B) olarak gösterilir. Exon II’de bulunan I-SceI bölgesine sahip muhabir geni, antisense transkripsiyonunu (EX2-AS) tespit etmek için I-SceI sitesinin yukarı akıştaki 24x MS2 kök döngü dizisinin paralel olmayan bir şekilde yerleştirilmesiyle (C) olarak gösterilmiştir. I-SceI-GR-iRFP füzyon proteini yapının işlevi (D) içinde grafiksel bir ekran ve aşağıdaki canlı hücrelerin ilgili görüntüleri ile gösterilmiştir. Muhabir gen hücresi çizgilerindeki yapının (kırmızı renk) geçici olarak ifade edildikten sonra, protein sadece sitoplazmiktir, bu da hedef bölgenin I-SceI endonuclease tarafından erken bölünmesini önler. TA ilavesi üzerine, füzyon proteini hücre çekirdeğine (kesikli bir çizgi ile gösterilir) göç etmeye başlar ve 5-15 dakika arasında birikmeye başlar. Ölçek çubuğu = 10 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Transkripsiyon sitelerinin 3D zaman atlamalı görüntülenmesi için hücrelerin seçilmesi. (A) fotoğrafta, canlı hücre görüntüleme için kullanılan 35 mm’lik cam tabanlı bir çanak, doğrudan büyüme ortamına seyreltilmiş TA’yı eklemek için 3 mm çapında bir delik açılan özel bir değiştirilmiş kapakla gösterilir. Delik konumu kırmızı bir daire ile işaretlenmiştir. (B) panelinde, canlı görüntülerin 3D zaman atlamalı alımı için tüm ayarları ayarlamak üzere ilgili “Yakalama” penceresinin ekran görüntüsü olan (C) içinde sonraki zaman atlamalı görüntüleme için canlı görüntü pozlama süresini, filtre ayarını, lazer yoğunluğunu ve ölçek görüntü görüntüsünü ayarlamak için mikroskop kontrol yazılımının “Odak” penceresinin ekran görüntüsü gösterilir. Filtre, Yakalama Türü, Zaman Atlamalı Yakalama ve 3D Yakalama bölmeleri için belirli ayarlar bölüm 3’te açıklanmıştır. Burada gösterilen görünümde, ayarlar, muhabir geninin promotör-proksimal bölgesinde DNA çift iplikçik kırılması indüksiyonu üzerine görüntüleme transkripsiyonu için MS2-GFP ve I-SceI-GR-iRFP yapıları ile transkripsiyonlu PROM muhabir gen hattının 3D zaman atlamalısını elde etmek için ayarlanır. (D) görüntüsü GFP ve iRFP kanalları için birleştirilir ve mikroskop sistemi aracılığıyla görüldüğü gibi, 293-PROM muhabir gen hücresi hattının birkaç hücresi ile bir görüş alanı gösterir. Hücreler, nükleer lokalizasyon dizisine kaynaşmış tandem dimer MS2 kat protein yapısı, iki yeşil floresan protein (GFP-MS2CP) ve I-SceI-GR-iRFP yapısı ile birlikte transkripsiyon edildi. Birkaç hücre GFP-MS2CP yapının ifadesini gösterir, böylece sitoplazmı vurgulayan çekirdek ve I-SceI-GR-iRFP yapısı vurgulanır. Kesikli kare, (E) olarak gösterilen büyütülmüş bölgeyi gösterir. 3D zaman atlamalı görüntüleme için hücreler, (D) bölgesindeki büyütülmüş bölgede daha büyük çekirdeğe sahip hücre gibi Tartışma’da verilen gereksinimlere göre seçilir. Bu hücre her iki floresan yapı ile transfekte edilir ve de novo transkriptörlü muhabir geni pre-mRNA’larda (sol görüntü) GFP-MS2CP biriktirilerek parlak etiketli bir transkripsiyon bölgesi (ok ucu) gösterir. Hücrelerin büyüme ortamı TA içermez; bu nedenle, I-SceI-GR-iRFP yapısı yalnızca sitoplazmiktir (sağ görüntü). (F) olarak, cam alt çanak, 3D zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için mikroskop aşaması inkübasyon odasına monte edilir ve TA yükleme deliğini içeren özel kapakla donatılmıştır. 200 μL mikropipette ucu, seyreltilmiş TA’yı hücrelerin büyüme ortamına uygulamak için deliğe dikkatlice yerleştirilir. Ölçek çubuğu = 10 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Görüntü alma ve analiz yazılımı. (A) panelinde STaQTool: Spot izleme ve nicelik aracının ekran görüntüsü gösterilir. Görüntü, prom muhabir gen hücresi çizgisinin örnek bir zaman serisini görüntüler ve ortadaki maksimum yoğunluk projeksiyon ekranında yeşil daire/beyaz kare ile işaretlenmiş etiketli transkripsiyon bölgesine sahiptir. Sağ taraftaki pencereler, seçilen transkripsiyon alanı noktasının büyütülmüş bir görünümünü, mevcut zaman noktası için 2D Gauss fit ızgarasına sahip ilgili 3D gölgeli yoğunluk yüzey çizimini ve z yığını içindeki transkripsiyon sitesi spot Z konumunun çizimlerini, Gauss uyum genişliğini (W) ve zaman içindeki TFI ölçümünü görüntüler. (B) deki mikroskobik görüntü, MS2-GFP ile transkripte edilmiş bir PROM muhabiri gen hücresi hattının çekirdeğinin yakınlaştırılmış tek optik düzlemini gösterir. Görüntü, 120 zaman noktasına sahip bir 2D kalibrasyon zaman serisinin tek seferlik noktasını temsil eder. Çekirdek, nükleoplazmada kırınım sınırlı nesneler olarak görünen floresan etiketli birkaç transkript gösterir (beyaz karelerle işaretlenmiştir). Sağ taraftaki panel, 2D zaman atlamalı alımlarda birden fazla noktayı analiz etmek için STaQTool’daki TFI ve W Dağıtımları aracının ekran görüntüsünü gösterir. Bu örnek analizde, araç nükleoplazmada yaygın olan MS2-GFP ile etiketlenmiş muhabir gen transkriptlerini temsil eden 408 kırınım sınırlı nokta tespit etti. Sağdaki grafikler, nesnelerin TFI ve Gauss uyum genişliği dağıtım histogramlarını ve Gauss uyum eğrilerini görüntüler. TFI ve W, Gauss uyum eğrisinin orta zirvesinin konumundan türetilen değerler anlamına gelir ve hesaplanan güven aralıkları ilgili bölmede görüntülenir. Ölçek çubuğu = 10 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: DNA çift iplikçik kırılmalarında transkripsiyon tespitinin temsili sonuçları. (A) ila (D) grafikleri, zaman içinde bir transkripsiyon bölgesinin kalibre edilmiş TFI eğrisini temsil eder. TFI değerleri, ilgili muhabir gen yapısı için kalibrasyon deneylerinde ölçülen tek transkriptlerin ortalama TFI’si ve ilgili deneyde kullanılan floresan etiketli RNA kök döngü bağlayıcı protein MS2 veya PP7 kullanılarak transkriptlere dönüştürülür. (A) içinde, TA ilavesi olmadan PROM muhabir geni kullanılarak yapılan bir kontrol deneyinden bir grafik gösterilir. MS2-GFP ile etiketlenmiş transkriptler, tüm gözlem süresi boyunca sürekli transkripsiyonal aktiviteyi gösterir. (B) grafik, bir DSB’nin TA eklenmesi ve indüksiyonu üzerine PROM muhabir genini temsil eder ve bu da kalan gözlem süresi boyunca transkripsiyonun bastırılmasına yol açar. (C)’deki EX2 muhabir gen grafiği, TA ilavesi üzerine kurallı promotör güdümlü transkripsiyonun transkripsiyon baskısını gösterir. Daha sonra aynı zaman atlamalı olarak, yalnızca PP7-RFP etiketli transkripsiyonal aktivite ortaya çıkar. (D) grafikte, kurallı promotörden duyu yönünde ex2-AS muhabir gen transkripsiyon, (C) in EX2 muhabir genine TA ilavesi üzerine benzer şekilde bastırılır. Bununla birlikte, ters eklenen MS2 kök döngü dizisinden kaynaklanan MS2-RFP etiketli transkriptlerin ortaya çıkması, TA eklemeden önce duyu transkripsiyon etkinliği sırasında bulunmayan antisense transkripsiyonunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Muhabir hücre satırı EX2 ve EX2-AS BALO Transfect için plazmidler 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP Tablo 1: Muhabir gen hücresi çizgilerinin transfeksiyon. Tablo, farklı muhabir gen hücresi çizgilerini geçici olarak transfectect etmek için kullanılan farklı plazmidlerin transfeksiyon şemalarını ve miktarlarını açıklamaktadır.

Discussion

Replikasyon, transkripsiyon, DNA hasarı ve DNA onarımı gibi temel biyolojik süreçler arasındaki çatışmalar, genom kararsızlığının kritik bir kaynağı olarak tanımlanmıştır22. Bu çalışmalar aynı zamanda DNA hasarı bölgelerinde transkripsiyonun keşfedilmesine yol açmış ve DNA hasar onarım süreçlerinin düzenlenmesinde kırılmaya bağlı transkriptlere işlevsel bir rol atfettirdi23. Burada açıklanan yeni araçlar ve protokol, DSB’lerdeki RNA Pol II transkripsiyon dinamiklerinin daha fazla araştırılmasına izin verir. Bu protokolde kritik bir nokta, genoma entegre edilen muhabir geninin tek bir kopyasını içeren hücre hatlarının üretilmesidir. Bu temel özellik, tek bir genomik lokus içinde birden fazla kopya ile entegre edilmiş birkaç muhabir geninin transkripsiyonunun yarattığı gürültüyü ortadan kaldırır ve transkripsiyon dinamiklerinin ve bireysel RNA transkriptlerinin kinetik parametrelerinin toplanmasına izin verir. Tek muhabir gen entegrasyonlarının transkripsiyonunu gözlemlemek için çok önemli bir teknik gereklilik, canlı hücrelerde MS2 veya PP7 sistemi ile etiketlenmiş tek RNA transkriptlerinin tespit edilmesine izin veren bir mikroskop sisteminin kullanılabilirliğidir4,12. Burada, canlı hücreli mikroskopi, ters bir mikroskop üzerine monte edilmiş, başka bir yerde açıklandığı gibi akustik optik ayarlanabilir filtreye bağlı 100 mW katı hal Lazerleri ile donatılmış bir Konfokal İplik Diski sisteminde gerçekleştirilir24. Ayrıca, muhabirleri kullanarak tek bir DSB’de transkripsiyonu incelemek için, tek tek hücrelerin birkaç saat boyunca görüntüleme hücreleri gerektiren en yüksek zaman çözünürlüğünü elde etmek için dikkatle izlenmesi gerekir, bu da bunu düşük verimli bir test haline getirir. Yine de piezo güdümlü mikroskop aşaması ile kontrol edilen konumlandırmaya paralel olarak birkaç hücre gözlemliyoruz. Saatler içinde canlı hücre gözlemi için en uygun çevresel koşulları sağlamak için, numune aşaması da dahil olmak üzere mikroskop gövdesi pleksiglas bir çevre odasının içine yerleştirilir. Ek olarak, mikroskop aşamasına kapalı bir sahne inkübasyon odası monte edilir ve CO2 ve nem besleme kontrolörlerine bağlanır.

Protokolün ilk kritik adımı, görüntüleme için hücrelerle ilgi çekici bölgelerin seçilmesidir. Görüntüleme için işaretlenmiş her XY pozisyonu, Bölüm 1, Tablo 1’de ve Şekil 2D, E’de açıklanan muhabir gen ve transfeksiyon şemasına göre floresan RNA kök döngü bağlayıcı proteinlerle transfeksiyon gösteren bir veya daha fazla hücre içermelidir. Ayrıca, hücreler parlak etiketli transkripsiyon bölgeleri I-SceI-GR-iRFP713 yapısı ile birlikte transkripsiyon edilmelidir ve protein başlangıçta sitoplazmada lokalize edilmelidir (Şekil 2D ve E).

Hücreler, arka plan floresan seviyesi üzerinde tek etiketli transkriptleri tespit edecek kadar düşük, sınırsız floresan etiketli MS2 ve/veya PP7 kat proteininin floresan yoğunluk seviyesini göstermelidir. Aynı zamanda, floresan etiketli MS2 ve/veya PP7 kat proteinlerinin sağlam bir floresan yoğunluk seviyesi, meydana gelen bazı ağartmalar nedeniyle çok fazla floresan kaybetmeden en az 60 dakika boyunca görüntülemeye izin vermek için gereklidir. Bölüm 3.7’de açıklandığı gibi sabit bir aralığa sahip “Ölçek görüntü ekranı”, floresan yoğunluk seviyelerine göre standartlaştırılmış bir hücre seçimine izin vermek için kullanılır.

İkinci bir kritik protokol adımı, CAM alt kabın kapağındaki küçük delikten önceden belirlenmiş XY konumlarındaki hücrelere TA’yı eklemektir. Cam alt kabın herhangi bir manipülasyonu, hücrelerin işaretli XY konumundan bir kaymaya neden olur ve kaçınılmalıdır. Bu nedenle, hücresel büyüme ortamına seyreltilmiş TA’yı eklerken mikropipleti dikkatlice işlemek, Şekil 2F’de gösterildiği gibi önceden seçilmiş hücrelerin başarılı gözlemi için hayati öneme sahiptir. Perfüzyon sistemi gibi mikroskop aşamasına monte edilmiş hücrelere ilaç eklemek için farklı sistemlerin uyarlanması, tüp giriş ve çıkış açıklıklarına sahip ayrı bir aşama inkübasyon odası ve ilaçları uygulamak için bir pompa veya enjeksiyon sistemi gerektirecektir. Kapak benzeri alt yüzeylere sahip kanal kaydırakları gibi diğer yöntemler, uygulanan ilaçların kanala yavaşça yayılmasına neden olur ve ilaç ekleme ve etkisi arasında ek bir gecikmeye neden olur. Son olarak, bir kanal slayt açıklığında incautious pipetleme de örnek konumunu değiştirebilir. Bu nedenle, cam tabanlı bir kabın kapağında özel bir delinmiş deliğe sahip mevcut sistemin uyarlandırılması kolaydır, düşük maliyetlidir ve farklı büyüme ortamlarını, ilaçları ve bileşenleri yönetmek için uygundur. Deliğin küçük çapı ve sahne inkübasyon odasındaki nemlendirilmiş atmosfer de hücre ortamından kurumasını önler.

Bu protokoldeki üçüncü bir kritik adım, bir DSB’nin indüksiyonu nedeniyle transkripsiyon durduğunda zaman noktalarının manuel olarak incelenmesini gerektiren veri analizidir. Transkripsiyonun sonlandırılmasının zaman noktası, muhabir gen transkripsiyonunun daha önce parlak etiketli bölgesinden son transkriptlerin serbest bırakılmasıyla belirtilir. Benzer şekilde, kırılma kaynaklı transkripsiyon başlatma olayları, tek floresan etiketli mRNA’ların nispeten düşük sinyal-gürültü oranına sahip bireysel transkripsiyon olaylarını tespit etmek için dikkatle denetlenmelidir.

İndüklenen DSB’nin onarım dinamikleri, bu muhabirler kullanılarak oluşturulan verilerin analizlerine ekstra bir karmaşıklık katmanı ekler ve bunları DSB’nin indüksiyondan hemen sonraki ilk dakikalarla sınırlar. Muhabir genlerinin transgenik doğası ve MS2 ve PP7 kök döngü dizilerinin tekrar bakımından zengin doğası, putatif kararlı kırılma kaynaklı transkripsiyon programları oluşturmaya engel olarak benzersiz bir kromatin manzarası oluşturabilir. Bununla birlikte, iyonlaştırıcı veya UV ışınlama ile karşılaştırıldığında, muhabir genlerinde bir DSB’nin I-SceI aracılı indüksiyonu, bireysel DSB’lerde transkripsiyonu araştırmak için çok daha sağlam bir sistemdir.

İnsan genomunda ek tanıma alanlarına sahip olan veya olmayan I-CreI, I-PpoI veya AsiSI gibi farklı endonuclease sistemleri, DSB’ler üretmenin olası daha yüksek verimliliği için mevcut muhabir gen sistemleriyle birleştirilebilir. Bununla birlikte, önce endonuclease tanıma sitesinin muhabir genlerine tanıtılması gerekir. İkincisi, bireysel hücrelerde bir DSB’nin zamanlaması ve verimlilik indüksiyonu konusunda benzer bir değişkenliğe sahip olabilirler. Öte yandan, endonükleaz tanıma sitelerinin tandem kopyalarının eklenmesi DSB indüksiyonunun verimliliğini artırabilir. Ayrıca, sunulan muhabir gen sistemlerinin farklı hücre hatlarında test etmek, DSB sahalarındaki transkripsiyon dinamiklerinin farklı hücresel arka planlar arasında karşılaştırılmasına ve kanser hücreleri, birincil hücreler ve farklılaştırılmış bisiklet dışı hücreler gibi farklı DNA hasar onarım yollarının mevcudiyetine izin verecektir. Bununla birlikte, Flp/FRT sistemi ile uyumlu olacak muhabir genlerinin inşası şu anda mevcut Flp/FRT ana bilgisayar hücre hatlarına entegrasyonu sınırlamaktır.

Mikroskopi tabanlı uygulamalara ek olarak, mevcut muhabir genleri, DNA onarım veya transkripsiyon faktörlerinin tek bir DSB’ye alımını incelemek veya DSB sahası çevresindeki nükleozom doluluğunu, histone modifikasyonlarını ve kromatin durumunu değerlendirmek için kromatin immünopepiyasyonu gibi biyokimyasal tahlillerle de birleştirilebilir. Ayrıca, farklı muhabir sistemleriyle bir kombinasyon, DNA hasarı ile genom organizasyonu veya DNA replikasyonu gibi süreçler arasındaki fonksiyonel bağlantıların incelenmesine izin verecektir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Plazmid ve reaktif hediyeleri için RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca’ya teşekkür ederiz. Ayrıca, makalenin eleştirel okunması için iMM Biyogörüntüleme Tesisi personeline, A. Temudo, A. Nascimento ve J. Rino’ya da borçluyuz. Bu çalışma PTDC/MED-OUT/32271/2017 tarafından finanse edilmiştir, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 ve PTDC/MED-OUT/4301/2020 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz ve LISBOA-01-0145-FEDER-007391 tarafından, FEDER tarafından POR Lisboa aracılığıyla finanse edilen proje, Portekiz 2020-Program Operacional Regional de Lisboa ve FCT. Fon, AB Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı’ndan (RiboMed 857119) da alındı. M.A., FCT Doktora bursu 2020.05899.BD.

Materials

100 mW solid-state Lasers Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin InvivoGen ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum Sigma-Aldrich F6765-500 ML
CO2 module S PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM Gibco 41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed Gibco 21063-029
Doxicyclin Sigma-Aldrich D9891 for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS Gibco 10270106
Flp-In T-REx 293 cell line Thermo Fischer Scientific Invitrogen R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence GeneArt, Thermo Fischer Scientific custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B Roche 10843555001
Immersion oil Immersol 518 F Carl Zeiss MicroImaging Inc.) 444960-0000-000
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 Thermo Fisher Scientific L3000001 transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 MatTek Corporation, Ashland, MA, USA P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO Thermo Fischer Scientific Invitrogen V652020
pOG44 plasmid Thermo Fischer Scientific Invitrogen V600520
SlideBook 6.0 Software Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software iMM-JLA Lisbon, Portugal available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA) Sigma-Aldrich T6501 synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE) Thermo Fisher Scientific R001100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d’Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
  3. Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
  4. Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
  5. Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
  6. Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
  7. Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
  8. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
  9. Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3′ ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
  10. Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
  11. Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
  12. Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
  13. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  14. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  15. Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
  16. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  17. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  18. Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
  19. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
  20. Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), 660 (2013).
  21. Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
  22. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  23. D’Alessandro, G., d’Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
  24. Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).

Tags

Keywords: Live-cell ImagingTranscriptional ActivityDNA Double-strand BreaksTranscription DetectionSingle-cell AnalysisDNA Damage ResponseTranscription-replication CrosstalkDoxycycline InductionCalibration MeasurementsMicrocentrifuge Tube PreparationTransfectionGlass Bottom DishMicroscopy Observation
check_url/fr/62968?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
de Almeida, M. R., Gameiro, E., de Almeida, S. F., Martin, R. M. Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks. J. Vis. Exp. (175), e62968, doi:10.3791/62968 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image