Визуализация транскрипционной активности живыми клетками при двухцепочечных разрывах ДНК
Summary
Этот протокол представляет новую репортерную генную систему и экспериментальную установку для обнаружения транскрипции при двухцепочечных разрывах ДНК с чувствительностью к одной молекуле.
Abstract
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) являются наиболее серьезным типом повреждения ДНК. Несмотря на катастрофические последствия для целостности генома, до сих пор остается неуловимым, как DSB влияют на транскрипцию. Причиной этого стало отсутствие подходящих инструментов для одновременного мониторинга транскрипции и индукции генного DSB с достаточным временным и пространственным разрешением. Эта работа описывает набор новых репортеров, которые непосредственно визуализируют транскрипцию в живых клетках сразу после индукции DSB в шаблоне ДНК. Стволовые петли РНК бактериофага используются для мониторинга транскрипции с одномолекулярной чувствительностью. Для нацеливания DSB на определенную область гена гены-репортеры спроектированы так, чтобы содержать одну последовательность распознавания самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI, в противном случае отсутствующей в геноме человека. Одна копия каждого гена-репортера была интегрирована в геном клеточных линий человека. Эта экспериментальная система позволяет обнаруживать одиночные молекулы РНК, генерируемые канонической транскрипцией гена или инициацией транскрипции, вызванной разрывом ДНК. Эти репортеры предоставляют беспрецедентную возможность для интерпретации взаимных взаимодействий между транскрипцией и повреждением ДНК и раскрытия до сих пор неоцененных аспектов транскрипции, вызванной разрывом ДНК.
Introduction
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой токсичные поражения ДНК, которые нарушают функцию клеток и способствуют возникновению ряда заболеваний и старению1. Мутации, возникающие в результате неточного восстановления DSB, влияют на экспрессию генов и закладывают основу для функционального упадка клетки. Возникающее мнение о том, что DSB управляют de novo прерываемой транскрипцией в месте поражения2,3,4,5,6,7, предполагает, что DSB могут также влиять на клеточную функцию через РНК, индуцированные разрывом. Несколько недавних исследований показывают, что DSB достаточны для инициирования запрограммированной (например, у генов, индуцируемых стимулами) и незапланированной (например, у неканонических промоторов) транскрипции4,5,7. Однако, несмотря на несколько исследований, изучающих связи между повреждением ДНК и транскрипцией, область все еще отставала в своей способности обеспечить точную (то есть одномолекулярную) характеристику транскрипционных событий в местах разрыва ДНК. Одной из важных причин этого было отсутствие соответствующих экспериментальных инструментов. Облучение клеток (γ лучей, рентгеновских лучей, тяжелых ионов) и медикаментозное лечение (например, ингибиторы топоизомеразы или интеркалирующие агенты) не имеют пространственной точности и индуцируют поражения ДНК, отличные от DSB, включая одноцепочечные разрывы и аддукты ДНК8. Эндонуклеазы, такие как I-PpoI и AsiSI, генерируют локус-специфические DSB, но не были объединены с системой, которая позволяет одновременно визуализировать транскрипцию в одном локусе с высокой временной точностью8. Чтобы обойти это ограничение, наша лаборатория возглавила разработку набора передовых репортеров, которые непосредственно визуализируют транскрипцию с разрешением одной молекулы при контролируемой индукции уникального DSB4. Здесь мы описываем этих репортеров, предоставляем подробный протокол для визуализации транскрипции живыми клетками в DSB и показываем данные, раскрывающие инициацию транскрипции в одном DSB.
Репортерные генные системы, используемые в этом протоколе, основаны на хорошо охарактеризованном мышином гене-репортере IgM и содержат экзоны M1 и M2 мембранно-связанной формы (мкм) тяжелой цепи IgM μ 9,10,11. Гибридный интрон разделяет два экзона сильным аденовирусным основным поздним транскриптом (AdML) PY tract12. Экспрессия генов-репортеров контролируется промотором цитомегаловируса человека (ЦМВ), в который вставлены две тандемные копии последовательности оператора Тета (ТетО). Каждый из генов-репортеров вставляется в плазмидный вектор, содержащий сайт Flp Recombination Target (FRT), и вставляется в определенный целевой сайт FRT в геноме клеточной линии хозяина HEK293. Эта клеточная линия также конститутивно экспрессирует белок репрессора Тета для регулирования экспрессии репортерного гена через присутствие или отсутствие тетрациклина / доксициклина. Чтобы обеспечить визуализацию транскрипции репортерного гена, 24 тандемных повтора последовательности стволовой петли MS2 и 24 тандемных повтора последовательности стволовой петли PP7 были вставлены в разные положения по отношению к месту начала транскрипции и структуре экзона/интрона репортерного гена. Стволовые петли РНК MS2/PP7 образуются при транскрипции и специфически связаны эктопически экспрессированными белками оболочки MS2/PP7, помеченными зелеными и красными флуоресцентными белками, стратегия, широко используемая ранее для визуализации транскрипции13,14,15. Кроме того, была вставлена единственная копия последовательности распознавания 18 bp для самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI, которая непосредственно окружена массивами последовательностей стволовой петли РНК в генах-репортерах. Для генерации всех плазмид использовались стандартные методы клонирования, фрагмент, содержащий стволовую петлю I-SceI-24xMS2 репортерного гена PROP, был синтезирован коммерческим сервисом синтеза генов.
Промоторно-проксимальный ген-репортер DSB (PROP) был построен путем вставки сайта резки I-SceI 45 пар оснований (bp) ниже по потоку предполагаемого начального сайта транскрипции в экзоне I, за которым следовал 149 bp до начала 24x MS2 стволовой петли кассеты, которая была de novo разработана с двумя чередующимися неидентичными последовательностями стволовых петель16 и дополнительные пять неповторяющихся последовательностей спейсеров 20 bp для уменьшения избыточности. За массивом стволовой петли MS2 следуют 72 bp до начала интрона 1844 bp и экзон II 1085 bp до расщепления и участка полиаденилирования. Экзон II кодирует голубой флуоресцентный белок (CFP), слитый с C-концевой пероксисомальной целевой последовательностью (PTS) из пероксисомальной ацилКоА-оксидазы человека, чтобы обеспечить независимый скрининг экспрессии репортерного гена (рисунок 1A).
Репортерный ген exon II DSB (EX2) состоит из экзона 167 bp I, за которым следуют интрон и экзон II, кодирующие CFP-PTS. Далее вниз по течению на расстоянии 169 bp была вставлена кассета, содержащая 24 штефонные петли MS2, за которой следовала последовательность линкера 84 bp с участком I-SceI в центре, за которой следовали 24x PP7 стволовые петли и 221 bp до расщепления и участка полиаденилирования17 (рисунок 1B).
Наконец, репортерный ген exon II DSB с антисмысловой транскрипцией (EX2AS) основан на транскрипте гена убиквитина B (UBB) человека UBB-201 и содержит два экзона и один интрон. Экзон I имеет общую длину 1534 bp с обратной вставкой последовательности 24x MS2 stem-loop. Таким образом, правильная последовательность стволовой петли РНК MS2 будет транскрибирована в антисмысловом направлении по отношению к чувственной транскрипции репортерного гена от промотора ЦМВ. Интрон имеет длину 490 bp, за которым следует экзон II с сайтом I-SceI , и область кодирования была вставлена для двух субъединиц убиквитина в кадре. Ниже по течению гена UBB находится последовательность, которая образует 24x PP7 стволовую петлю при транскрипции репортерного гена в смысловом направлении (рисунок 1C).
Транзиторная трансфекция индуцируемой конструкции самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI позволяет контролировать создание DSB во вставленном месте распознавания в каждом гене-репортере18. Эндонуклеаза I-SceI сливается в рамке с лигандсвязывающим доменом глюкокортикоидного рецептора и дальнекрасным флуоресцентным белком iRFP713. Эта конструкция цитоплазматическая в отсутствие триамцинолона ацетонида (ТА), но быстро мигрирует в ядро при добавлении ТА к среде роста клеток (рисунок 1D). Индукция DSB системой I-SceI является надежной, как было продемонстрировано ранее18,19,20. Транскрипцию репортерного гена можно контролировать параллельно, визуализируя флуоресцентно помеченные системы стволовых петель РНК MS2 и PP7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Конфликты между основными биологическими процессами, такими как репликация, транскрипция, повреждение ДНК и восстановление ДНК, были идентифицированы как критический источник нестабильности генома22. Эти исследования также привели к открытию транскрипции на участках повреждения ДНК и придали функциональную роль транскриптам, индуцированным разрывом, в регулировании процессов восстановления повреждений ДНК23. Новые инструменты и протокол, описанный здесь, позволяют продолжить исследование динамики транскрипции РНК Pol II на DSB. Критической точкой в этом протоколе является генерация клеточных линий, которые содержат одну копию гена-репортера, интегрированного в геном. Эта ключевая особенность устраняет шум, создаваемый транскрипцией нескольких репортерных генов, интегрированных с несколькими копиями в пределах одного геномного локуса, и позволяет собирать кинетические параметры динамики транскрипции и отдельные транскрипты РНК. Важнейшим техническим требованием для наблюдения за транскрипцией интеграций генов-репортеров является наличие системы микроскопа, которая позволяет обнаруживать одиночные транскрипты РНК, помеченные системой MS2 или PP7 в живых клетках4,12. Здесь микроскопия живых клеток выполняется на системе Confocal Spinning Disk, установленной на инвертированном микроскопе, оснащенном твердотельными лазерами мощностью 100 мВт, соединенными с акустическо-оптическим перестраиваемым фильтром, как описано в другом месте24. Кроме того, чтобы изучить транскрипцию в одном DSB с использованием репортеров, отдельные клетки должны тщательно контролироваться для достижения наивысшего временного разрешения, что требует визуализации клеток в течение нескольких часов, что делает это анализом с низкой пропускной способностью. Тем не менее, мы наблюдаем несколько клеток параллельно с позиционированием, контролируемым ступенью пьезоуправляемого микроскопа. Для обеспечения оптимальных условий окружающей среды для наблюдения за живыми клетками в течение нескольких часов корпус микроскопа, включая стадию образца, помещают внутрь камеры окружающей среды из плексигласа. Кроме того, на ступени микроскопа установлена инкубационная камера с закрытой стадией и подключена к контроллерам подачи CO2 и влажности.
Первым критическим шагом в протоколе является выбор областей, представляющих интерес, с клетками для визуализации. Каждое положение XY, отмеченное для визуализации, должно содержать одну или несколько клеток, демонстрирующих трансфекцию флуоресцентных белков, связывающих стволовую петлю РНК в соответствии с репортерным геном и схемой трансфекции, описанной в разделе 1, таблица 1, а также на рисунке 2D, E. Кроме того, клетки должны иметь ярко меченые участки транскрипции, которые должны быть котрансфицированы конструкцией I-SceI-GR-iRFP713, и белок должен быть локализован первоначально в цитоплазме (рисунок 2D и E).
Клетки должны показывать уровень интенсивности флуоресценции несвязанного флуоресцентно помеченного белка MS2 и/или PP7, достаточно низкий, чтобы обнаружить одиночные меченые транскрипты на уровне фоновой флуоресценции. В то же время, устойчивый уровень интенсивности флуоресценции флуоресцентно помеченных белков покрытия MS2 и / или PP7 необходим, чтобы обеспечить визуализацию в течение не менее 60 минут без потери слишком большой флуоресценции из-за некоторого отбеливания, которое происходит. «Масштабный дисплей изображения» с фиксированным диапазоном, как описано в разделе 3.7, используется для стандартизированного выбора ячеек в соответствии с их уровнем интенсивности флуоресценции.
Вторым критическим этапом протокола является добавление TA в ячейки в заранее определенных положениях XY через небольшое отверстие в крышке стеклянной нижней чашки. Любые манипуляции со стеклянной нижней тарелкой приведут к смещению клеток от отмеченного положения XY и их следует избегать. Поэтому тщательное обращение с микропипеткой при добавлении ТА, разбавленной в клеточной среде роста, имеет жизненно важное значение для успешного наблюдения за предварительно отобранными клетками, как показано на рисунке 2F. Адаптация различных систем для добавления лекарств в клетки, установленные на стадии микроскопа, таких как перфузионная система, потребует отдельной инкубационной камеры с входными и выходными отверстиями для трубок и насосной или инъекционной системы для введения лекарств. Другие методы, такие как слайды каналов с покрытыми нижними поверхностями, приводят к медленной диффузии вводимых лекарств в канал и вызывают дополнительную задержку между добавлением и эффектом лекарственного средства. Наконец, неосторожное пипетирование в отверстие скольжения канала также может сместить положение образца. Таким образом, настоящая система с специально просверленным отверстием в крышке тарелки со стеклянным дном проста в адаптации, имеет низкую стоимость и подходит для введения различных питательных сред, лекарств и компонентов. Малый диаметр отверстия и увлажненная атмосфера в инкубационной камере стадии также предотвращает высыхание клеточной среды.
Третьим критическим шагом в этом протоколе является анализ данных, который требует ручной проверки временных точек, когда транскрипция прекращается из-за индукции DSB. Временная точка прекращения транскрипции указывается высвобождением последних транскриптов с ранее ярко обозначенного участка транскрипции репортерного гена. Аналогичным образом, события инициации транскрипции, вызванной разрывом, должны быть тщательно проверены для обнаружения отдельных событий транскрипции с относительно низким отношением сигнал/шум одиночных флуоресцентно меченых мРНК.
Динамика восстановления индуцированного DSB добавляет дополнительный уровень сложности к анализу данных, генерируемых с помощью этих репортеров, ограничивая их первыми минутами сразу после индукции DSB. Трансгенная природа репортерных генов и богатая повторяемостью природа стержневых матриц MS2 и PP7 могут собрать уникальный ландшафт хроматина, мешая созданию предполагаемых стабильных программ транскрипции, вызванных разрывом. Тем не менее, по сравнению с ионизирующим или УФ-облучением, Опосредованная I-SceI индукция DSB в репортерных генах является гораздо более надежной системой для исследования транскрипции в отдельных DSB.
Различные эндонуклеазные системы, такие как I-CreI, I-PpoI или AsiSI , которые имеют или не имеют дополнительные сайты распознавания в геноме человека, могут быть объединены с существующими репортерными генными системами для возможной более высокой эффективности генерации DSB. Тем не менее, они требуют сначала введения сайта распознавания эндонуклеазы в гены-репортеры. Во-вторых, они могут иметь аналогичную изменчивость по срокам и эффективности индукции DSB в отдельных клетках. С другой стороны, вставка тандемных копий сайтов распознавания эндонуклеазы может повысить эффективность индукции DSB. Кроме того, тестирование представленных репортерных генных систем в разных клеточных линиях позволит сравнить динамику транскрипции на участках DSB между различными клеточными фонами и наличие различных путей восстановления повреждений ДНК, таких как раковые клетки, первичные клетки и дифференцированные нециклические клетки. Однако построение генов-репортеров, совместимых с системой Flp/FRT, в настоящее время ограничивает интеграцию в доступные клеточные линии хозяина Flp/FRT.
В дополнение к приложениям, основанным на микроскопии, текущие гены-репортеры также могут быть объединены с биохимическими анализами, такими как иммунопреципитация хроматина, для изучения набора факторов репарации ДНК или транскрипции в один DSB или для оценки занятости нуклеосом, модификаций гистонов и состояния хроматина вокруг сайта DSB. Кроме того, комбинация с различными репортерными системами позволит изучать функциональные связи между повреждением ДНК и такими процессами, как организация генома или репликация ДНК.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca за подарки плазмид и реагентов. Мы также в долгу перед сотрудниками iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento и J. Rino, за критическое прочтение рукописи. Эта работа финансировалась PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 и PTDC/MED-OUT/4301/2020 от Фонда за ciência e a Tecnologia (FCT), Португалия и LISBOA-01-0145-FEDER-007391, проект, совместно финансируемый FEDER через POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa и FCT. Финансирование также было получено от Программы исследований и инноваций ЕС Horizon 2020 (RiboMed 857119). M.A. является получателем стипендии FCT Ph.D. 2020.05899.BD.
Materials
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d’Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
- Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
- Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
- Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
- Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
- Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
- Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3′ ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
- Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
- Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
- Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
- Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), 660 (2013).
- Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
- Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
- D’Alessandro, G., d’Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
- Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).
