Denne protokol præsenterer et nyt reporter-gensystem og den eksperimentelle opsætning til at opdage transskription ved DNA-dobbeltstrengsbrud med enkeltmolekylefølsomhed.
DNA-dobbeltstrengspauser (DSB) er den alvorligste type DNA-skader. På trods af de katastrofale konsekvenser for genomets integritet er det indtil videre undvigende, hvordan DSBs påvirker transskription. En af grundene hertil var manglen på egnede værktøjer til samtidig at overvåge transskription og induktion af en gen DSB med tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning. Værket beskriver en række nye journalister, der direkte visualiserer transskription i levende celler umiddelbart efter induktionen af en DSB i DNA-skabelonen. Bacteriophage RNA stilk-loops anvendes til at overvåge transskription med enkelt-molekyle følsomhed. For at målrette DSB mod en bestemt genregion er reportergenerene konstrueret til at indeholde en enkelt anerkendelsessekvens af den homing endonuclease I-SceI, ellers fraværende fra det menneskelige genom. En enkelt kopi af hvert reporter gen blev integreret i genomet af menneskelige cellelinjer. Dette eksperimentelle system gør det muligt at påektionere enkelte RNA-molekyler genereret af den kanoniske gentransskription eller ved DNA-brud-induceret transskription indledning. Disse journalister giver en hidtil uset mulighed for at fortolke de gensidige interaktioner mellem transskription og DNA-skader og for at afsløre hidtil ikke værdsatte aspekter af DNA-brud-induceret transskription.
DNA dobbeltstrengede brud (DSBs) er giftige DNA-læsioner, der forstyrrer cellefunktionen og bidrager til opblussen af flere sygdomme og aldring1. Mutationer som følge af den unøjagtige reparation af DSBs påvirker genekspressionen og danner grundlag for cellens funktionelle tilbagegang. Den emergente opfattelse, at DSBs drive de novo break-induceret transskription på læsion site2,3,4,5,6,7 tyder på, at DSBs kan også påvirke cellulære funktion gennem break-induceret RNA’er. Flere nylige undersøgelser tyder på, at DSBs er tilstrækkelige til at indlede programmerede (f.eks. ved stimulus-indukible gener) og uplanlagt (f.eks. hos ikke-kanoniske initiativtagere) transskription4,5,7. På trods af flere undersøgelser, der undersøgte sammenhængen mellem DNA-skader og transskription, haltede feltet dog stadig i sin evne til at levere en præcis (dvs. enkeltmolekyle) karakterisering af transskriptionernes hændelser på DNA-pausesteder. En vigtig årsag til dette var manglen på passende eksperimentelle værktøjer. Cellebestråling (γ stråler, røntgenstråler, tunge ioner) og lægemiddelbehandlinger (f.eks. topoisomerasehæmmere eller interkaleringsmidler) mangler rumlig præcision og fremkalder andre DNA-læsioner end DSBs, herunder enkeltstrengede pauser og DNA-adducts8. Endonucleaser, såsom I-PpoI og AsiSI, genererer locus-specifikke DSBs, men er ikke blevet kombineret med et system, der tillader samtidig live-celle visualisering af transskription på et enkelt græshoppe med høj tidsmæssig præcision8. For at omgå denne begrænsning stod vores laboratorium i spidsen for at udvikle et sæt banebrydende journalister, der direkte visualiserer transskription med enkeltmolekyleopløsning ved kontrolleret induktion af en unik DSB4. Her beskriver vi disse journalister, giver en detaljeret protokol for live-celle billeddannelse af transskription på DSBs og viser data, der afslører transskription indledning på en enkelt DSB.
De reporter gensystemer, der anvendes i denne protokol er baseret på velkarakteriseret mus IgM reporter gen og indeholder exons M1 og M2 af membranen-bundet form (μm) af IgM μ tunge kæde9,10,11. En hybrid intron adskiller de to exons med den stærke adenovirus større sen udskrift (AdML) PY tract12. Udtrykket af reporter gener styres af den menneskelige cytomegalovirus promotor (CMV), hvori to tandem kopier af Tet operatør (TetO) sekvens er blevet indsat. Reporter gener er hver indsat i en plasmid vektor, der indeholder en Flp Recombination Target (FRT) site og indsat i en bestemt FRT mål site i genomet af en HEK293 værtscelle linje. Denne celle linje også konstituerende udtrykker Tet repressor protein til at regulere ekspressionen af reporter genet via tilstedeværelsen eller fraværet af tetracyklin / doxycyclin. For at tillade visualisering af reporter gen transskription, 24 tandem gentagelser af MS2 stilk loop sekvens og 24 tandem gentagelser af PP7 stilk loop sekvens blev indsat på forskellige positioner med hensyn til transskription startsted og exon / intron struktur reporter genet. MS2/PP7 RNA-stilkens sløjfer dannes ved transskription og er specifikt bundet af ektopisk udtrykte MS2/PP7-frakkeproteiner mærket med grønne og røde fluorescerende proteiner, en strategi, der i vid udstrækning blev brugt før til billedtransskription13,14,15. Derudover blev en enkelt kopi af 18 bp anerkendelse sekvens indsat for homing endonuclease I-SceI, der er direkte flankeret af RNA stem-loop sekvens arrays i reporter gener. Standard kloning teknikker blev brugt til at generere alle plasmider, fragmentet indeholder I-SceI-24xMS2 stilk-loop af PROP reporter genet blev syntetiseret af en kommerciel gensyntetisering tjeneste.
Det proksimale DSB-reportergen (PROP) blev konstrueret ved at indsætte I-SceI-skærestedet 45 basispar (bp) nedstrøms putativt transskriptionstartsted i exon I, efterfulgt af 149 bp indtil starten af 24x MS2 stem-loop-kassetten, som var de novo designet med to skiftevis ikke-identiske stilk-loop sekvenser16 og yderligere fem ikke-gentagne 20 bp spacer sekvenser for at reducere redundans. MS2 stem-loop array efterfølges af 72 bp indtil begyndelsen af 1844 bp intron og 1085 bp exon II indtil kavalergang og polyadenylation site. Exon II koder et cyan fluorescerende protein (CFP), der er smeltet sammen til en C-terminal peroxisomal targeting sequence (PTS) fra den humane peroxisomale acyl CoA-oxidase for at muliggøre en uafhængig screening af reportergentrykket (Figur 1A).
Exon II DSB reporter genet (EX2) består af en 167 bp exon jeg efterfulgt af intron og exon II kodning af den fælles fiskeripolitik-PTS. Længere nede ad floden i en afstand af 169 bp blev der indsat en kassette med 24x MS2-stængselsløjfer efterfulgt af en 84 bp linkersekvens med et I-SceI-sted i midten efterfulgt af 24x PP7-stængselsløjfer og 221 bp indtil kavalergangen og polyadenylationsstedet17 (figur 1B).
Endelig er exon II DSB reporter genet med antisense transskription mærkning (EX2AS) er baseret på den menneskelige ubiquitin B (UBB) genudskrift UBB-201 og indeholder to exons og en intron. Exon jeg har en samlet længde på 1534 bp med en omvendt indsættelse af 24x MS2 stilk-loop sekvens. Derfor vil den korrekte MS2 stem-loop RNA sekvens blive transskriberet i en antisense retning med hensyn til den forstand transskription af reporter genet fra CMV promotor. Intronen har en længde på 490 bp, efterfulgt af exon II med I-SceI-webstedet , og der blev indsat et kodningsområde for to in-frame ubiquitin-underenheder. Nedstrøms af UBB genet er en sekvens, der danner en 24x PP7 stem-loop ved transskription af reporter genet i en vis retning (Figur 1C).
Den forbigående gennemgående transfektion af en induktiv konstruktion af den homing endonuclease I-SceI giver mulighed for kontrolleret oprettelse af en DSB på det indsatte anerkendelsessted inden for hvert reporter-gen18. I-SceI endonuclease er smeltet sammen i ramme med ligand-bindende domæne glucocorticoid receptor og en langt rød fluorescerende protein iRFP713. Denne konstruktion er cytoplasmisk i mangel af triamcinolone acetonid (TA), men migrerer hurtigt ind i kernen ved tilsætning af TA til cellernes vækstmedium (Figur 1D). I-SceI-systemets induktion af DSBs er robust, som det blev påvist før 18.19,20. Reporter gen transskription kan overvåges parallelt ved at visualisere fluorescerende mærket RNA stilk-loop systemer MS2 og PP7.
Konflikter mellem væsentlige biologiske processer såsom replikation, transskription, DNA-skader og DNA-reparation er blevet identificeret som en kritisk kilde til genom ustabilitet22. Disse undersøgelser har også ført til opdagelsen af transskription på steder af DNA-skader og tilskrives en funktionel rolle til break-induceret udskrifter i reguleringen af DNA-skader reparation processer23. De nye værktøjer og den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for yderligere undersøgelse af RNA Pol II transskription dynamik på DSBs. Et kritisk punkt i denne protokol er dannelsen af cellelinjer, der indeholder en enkelt kopi af reporter genet integreret i genomet. Denne nøglefunktion eliminerer støj skabt af transskription af flere reporter gener integreret med flere kopier inden for en enkelt genomisk græshoppe og tillader indsamling af kinetiske parametre transskription dynamik og individuelle RNA udskrifter. Et afgørende teknisk krav for at observere transskription af enkelt reporter genintegrationer er tilgængeligheden af et mikroskop system, der gør det muligt at opdage enkelt RNA udskrifter mærket med MS2 eller PP7 system i levende celler4,12. Her udføres levende cellemikroskopi på et Confocal Spinning Disk-system monteret på et omvendt mikroskop, udstyret med 100 mW solid-state lasere koblet til et akustisk optisk tunbart filter som beskrevet andetsteds24. For at studere transskription hos en enkelt DSB ved hjælp af journalisterne skal de enkelte celler desuden overvåges nøje for at opnå den højeste tidsopløsning, hvilket kræver billedceller i flere timer, hvilket gør dette til en lav gennemløbsanalyse. Alligevel observerer vi flere celler parallelt med positionering kontrolleret af et piezodrevet mikroskopstadium. For at sikre optimale miljøforhold for levende celleobservation over timer placeres mikroskopkroppen, herunder prøvestadiet, inde i et plexiglasmiljøkammer. Derudover er et lukket fase inkubation kammer monteret på mikroskop fase og forbundet til CO2 og fugtighed levering controllere.
Det første kritiske trin i protokollen er udvælgelsen af områder af interesse med celler til billeddannelse. Hver XY-position, der er markeret til billeddannelse, skal indeholde en eller flere celler, der viser transfektion med de fluorescerende RNA-stamløkkebindende proteiner i henhold til det reportergen- og transfektionsprogram, der er beskrevet i afsnit 1, tabel 1, samt i figur 2D, E. Desuden skal cellerne udvise lyse mærkede transskriptionssteder skal være co-transfected med I-SceI-GR-iRFP713 konstruktion, og proteinet skal lokaliseres i første omgang i cytoplasma (figur 2D og E).
Cellerne skal udvise et fluorescensintensitetsniveau af ubundet fluorescerende mærket MS2 og/eller PP7-frakkeprotein, der er lavt nok til at detektere enkeltmærkede udskrifter over baggrundslyscensniveauet. Samtidig er et robust fluorescensintensitetsniveau for de fluorescerende mærkede MS2- og/eller PP7-frakkeproteiner nødvendigt for at tillade billeddannelse over mindst 60 min uden at miste for meget fluorescens på grund af nogle blegning, der opstår. “Skaler billedvisning” med et fast område som beskrevet i afsnit 3.7 bruges til at muliggøre et standardiseret udvalg af celler i henhold til deres fluorescensintensitetsniveau.
Et andet kritisk protokoltrin er at tilføje TA til cellerne på forudbestemte XY-positioner gennem det lille hul i låget på glasbundsskålen. Enhver manipulation af glasbundsskålen ville medføre et skift fra cellernes markerede XY-position og skal undgås. Derfor er omhyggelig håndtering af mikropipetten, samtidig med at den fortyndede TA fortyndes i det cellulære vækstmedium, afgørende for forhåndsvalgte cellers vellykkede observation, som det fremgår af figur 2F. Tilpasningen af forskellige systemer til at tilføje lægemidler til celler monteret på et mikroskop fase, såsom en perfusion system, ville kræve et separat fase inkubation kammer med rør indgang og udgang åbninger og en pumpe eller injektion system til at administrere narkotika. Andre metoder såsom kanal dias med coverslip-lignende bundoverflader resultere i en langsom diffusion af administrerede lægemidler i kanalen og forårsage en ekstra forsinkelse mellem lægemiddeltilsætning og effekt. Endelig kan glødende pipetter i en kanal slide åbning flytte prøven position så godt. Derfor er det nuværende system med et brugerdefineret boret hul i låget på en glasbundet skål ligetil at tilpasse, lave omkostninger og egnet til administration af forskellige vækstmedier, stoffer og komponenter. Hullets lille diameter og den befugtede atmosfære i faseinkubationkammeret forhindrer også udtørring af cellemediet.
Et tredje kritisk skridt i denne protokol er dataanalysen, som kræver en manuel inspektion af de tidspunkter, hvor transskriptionen ophører på grund af induktionen af en DSB. Tidspunktet for afslutning af transskription er angivet ved at frigive de sidste udskrifter fra det tidligere lyse mærkede sted for reportergentransskriptionen. På samme måde skal hændelserne med udbrudsinduceret transskription indledning inspiceres med omhu for at opdage individuelle transskription hændelser med relativt lavt signal-til-støj-forhold for enkelt fluorescerende mærket mRNAs.
Dynamikken i reparationen af den inducerede DSB tilføjer et ekstra lag af kompleksitet til analyserne af data, der genereres ved hjælp af disse reportere, hvilket begrænser dem til de første minutter umiddelbart efter induktion af DSB. Den transgene karakter af reporter gener og den gentagne-rige karakter af MS2 og PP7 stem-loop arrays kan samle en unik kromatin landskab, forstyrrer oprettelse putative stabil break-induceret transskription programmer. Ikke desto mindre er I-SceI-mæcensningen af en DSB i reportergener et langt mere robust system til at undersøge transskription ved individuelle DSB’er sammenlignet med imitisering eller UV-bestråling.
Forskellige endonuclease systemer såsom I-CreI, I-PpoI, eller AsiSI , der har eller ikke har yderligere anerkendelse steder inden for det menneskelige genom kan kombineres med den nuværende reporter gensystemer for en mulig højere effektivitet for at generere DSBs. Men de kræver først at indføre endonuclease anerkendelse site i reporter gener. For det andet kan de have en lignende variation i timingen og effektiviteten induktion af en DSB i de enkelte celler. På den anden side kan indsættelse af tandemkopier af endonucleasegenkendelsessteder øge effektiviteten af DSB’s induktion. Desuden vil test af de præsenterede reporter-gensystemer i forskellige cellelinjer gøre det muligt at sammenligne transskriptionsdynamikken på DSB’s lokaliteter mellem forskellige cellebaggrunde og tilgængeligheden af forskellige DNA-skadesreparationsveje som i kræftceller, primære celler og differentierede ikke-cykelceller. Men opførelsen af de reportergener, der skal være kompatible med FLP/FRT-systemet, begrænser i øjeblikket integrationen i tilgængelige FLP/FRT-værtscellelinjer.
Ud over mikroskopibaserede anvendelser kan de nuværende reportergener også kombineres med biokemiske analyser, såsom kromatinimmunptur, for at studere rekrutteringen af DNA-reparations- eller transskriptionsfaktorer til en enkelt DSB eller for at vurdere nukleosombelægning, histonemodifikationer og kromatintilstand omkring DSB-webstedet. Desuden vil en kombination med forskellige reportersystemer gøre det muligt at studere funktionelle forbindelser mellem DNA-skader og processer som genomorganisation eller DNA-replikation.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca for gaver af plasmider og reagenser. Vi står også i gæld til iMM Bioimaging Facility personale, A. Temudo, A. Nascimento, og J. Rino, for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 og PTDC/MED-OUT/4301/2020 from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal og af LISBOA-01-0145-FEDER-007391, projekt cofunded af FEDER gennem POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa og FCT. Der blev også modtaget støtte fra EU’s Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram (RiboMed 857119). M.A. er modtager af FCT Ph.D. stipendiet 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |