التصوير الحي لنظام الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية المثقفة
Summary
توضح هذه المقالة طريقة التصوير الزمني الميتوكوندريا لثقافات الخلايا الفلكية المجهزة بمساح حيوي MitoTimer والتحليل متعدد البارامترات الناتج عن ديناميكيات الميتوكوندريا والتنقل والمورفولوجيا والتكوين الحيوي وحالة الأكسدة والدوران.
Abstract
في حين تم إيلاء الكثير من الاهتمام لتعديلات الميتوكوندريا على مستوى الخلايا العصبية، تظهر الأدلة الأخيرة أن ديناميات الميتوكوندريا ووظيفتها في الخلايا الفلكية متورطة في الإدراك. توضح هذه المقالة طريقة التصوير الفاصل الزمني لثقافات الخلايا الفلكية المجهزة بمساح حيوي الميتوكوندريا: MitoTimer. MitoTimer هو أداة قوية وفريدة من نوعها لتقييم ديناميات الميتوكوندريا، والتنقل، مورفولوجيا، التكوين الحيوي، وحالة الأكسدة. هنا ، يتم تقديم الإجراءات المختلفة للثقافة ، واكتساب الصور ، وتحليل الميتوكوندريا اللاحق.
Introduction
الخلايا الفلكية هي لاعبين حاسمين في الحفاظ على التوازن في الدماغ. هم ربما أكثر معروفة أن يكون لها أدوار هيكلية كبيرة في الدماغ, كجزء من حاجز الدم في الدماغ1 ودعم الخلايا العصبية ونقاط الاشتباك العصبي في جميع أنحاء الدماغ2. دعم الخلايا الفلكية من الخلايا العصبية على حد سواءالهيكلية 3 والأيض4,5, مع الخلايا الفلكية تعزيز تكوين الأعصاب وتولد الخلايا النابعة في حين توفر أيضا الأيض الرئيسية مثل اللاكتات إلى الخلايا العصبية النشطة4,6,7. وراء دور الدعم الهيكلي، والخلايا الفلكية هي الخلايا النشطة التي تشارك في Ca2 + الإشارات والتخزين المؤقت (بما في ذلك عفوية الميتوكوندريا Ca2 + التدفقات)8،9، K+ التخزين المؤقت10،ويمكن التكيف والتفاعل مع احتياجات الدماغ في أوقات الإصابة11،12 . كونها مثل هذه الخلايا الديناميكية، الخلايا الفلكية لديها متطلبات الطاقة قوية، الأمر الذي يتطلب شبكة الميتوكوندريا كفاءة. هذه الميتوكوندريا لها أيضا دور حاسم في التخزين المؤقت لأنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS)13. بالإضافة إلى أدوارهم الفردية أو المحلية لتوليد الطاقة والتخزين المؤقت ل ROS ، تعمل الميتوكوندريا كشبكة14. وبهذا المعنى، فإنها تحافظ على التوازن بين الانشطار وانصهار الميتوكوندريا، التي تمثل الميتوكوندريا الجديدة / المخفضة والميتوكوندريا القديمة / المؤتأكسدة، على التوالي15. يمكن قياس حالة الأكسدة الشاملة للخلية من خلال حالة الأكسدة لشبكة الميتوكوندريا. في علم الأمراض ، وهذا هو قطعة حاسمة من المعلومات التي يمكن أن تلقي الضوء على الخلايا التي قد لا تعمل على النحو الأمثل.
في السنوات الأخيرة، تم تطوير العديد من أجهزة الاستشعار لدراسة ديناميات ووظائف الميتوكوندريا في الخلايا. على سبيل المثال، أجهزة الاستشعار قياس تبادل الطاقة (ATP)، حالة الأكسدة (NADH / NAD+، ROS)، وظائف الأنزيمية (cAMP، Ca2 +، ZN2 +) تستخدم حاليا في دراسة وظيفة الميتوكوندريا16. من بينها ، يسمح MitoTimer لمتابعة التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا (الحجم والشكل والمساحة السطحية) ، والتنقل (السرعة والإزاحة) ، والديناميكيات (أحداث الانصهار والانفطار) ، بالإضافة إلى معدل دوران الميتوكوندريا العام وحالة الأكسدة. MitoTimer هو بروتين فلوري أحمر متحول ، drFP58317، مع إشارة الميتوكوندريا من الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم البشري c oxidase18،19 لتصور الميتوكوندريا المركبة حديثا باللون الأخضر (488 نانومتر) والميتوكوندريا المؤاتدة باللون الأحمر (555 نانومتر). باستخدام الأخضر (488 نانومتر) والأحمر (555 نانومتر) نسبة الفلورية يسمح التقييم المتزامن للميتوكوندريا الفردية, تحليلها مورفولوجيا, الانصهار / الانشطار الأحداث, وتاريخ الدولة أكسدة20,21. يمكن استخدام هذه الخاصية الفريدة للتحقيق في العديد من الأسئلة العلمية المتعلقة بأدوار الميتوكوندريا الفسيولوجية والمرضية ، وبالتالي فهي واعدة للغاية للكشف عن الآليات الأساسية لديناميكيات الميتوكوندريا داخل العديد من أنواع الخلايا المختلفة.
قمنا مؤخرا بتطوير ناقل العدسة الجديدة (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, فيما بعد يسمى LV-G1-MitoTimer) لدراسة ديناميكية الميتوكوندريا ووظائفها على وجه التحديد في الخلايا الفلكية في المختبر وفي الجسم الحي22. يستخدم LV-G1-MitoTimer نسخة مبتورة من البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) المروج gfaABC1D، مع محسن B3 (gfaABC1D(B3)، وتسمى فيما بعد G1) جنبا إلى جنب مع نظام إلغاء الاستهداف العصبي miR124T الموصوف سابقا23. فإنه يسمح التعبير الحصري للمضاء الحيوي الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية في المختبر وفي الجسم الحي22. هنا هي الخطوات المختلفة لأداء ثقافة الخلايا الفلكية فرس النهر الفئران وتجهيزها مع LV-G1-MitoTimer الاستشعار الحيوي, فضلا عن خطوات المجهر المختلفة لمتابعة سلوك الميتوكوندريا الخلايا الفلكية خلال عدة ساعات متتالية / أيام.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يقترح طريقة جديدة لمتابعة ديناميات ودوران نظام الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية المثقفة. على عكس نهج الفاصل الزمني على مجموعة ثابتة من الخلايا أو خلية واحدة فردية في وقت واحد (غالبا ما تستخدم في الأدب)24،25، يمكن للباحثين متابعة تطور نظام الميتوكوندريا خلال عدة أيام على نفس الخلايا الفردية. على النقيض من التصوير الحي بشكل جيد واحد حيث هناك حاجة إلى مستويات عالية من التعرض للضوء ، واختيار العديد من الخلايا الفردية أقل جدوى ، فإن الطريقة المقترحة تستفيد من قدرة هذا المجهر على تصوير العديد من الخلايا المختلفة في مناطق مختلفة من البئر والعودة إلى تلك الخلايا نفسها في نقاط زمنية مختلفة لإعادة تصويرها. وبفضل التطبيع مع خط الأساس الذي يتم تنفيذه لكل معيار محسوب على كل خلية من الخلايا ذات الاهتمام، فإنه يأخذ تعقيد نظام الميتوكوندريا في الاعتبار ويحقق في تأثير العلاج على كل خلية بالنسبة لصورتها الأساسية الخاصة. قدرة المجهر على تنفيذ هذا النوع من التصوير بشكل مستقل على ما يصل إلى 16 بئرا في وقت واحد (تصوير 5 خلايا لكل بئر) يسمح بتغاير نظام الميتوكوندريا يؤخذ في الاعتبار بشكل صحيح أثناء التحليل دون التغير التجريبي الذي يأتي مع تصوير ظروف مختلفة في أيام مختلفة.
نوعية الثقافات، ومستويات العدوى الفيروسية التي تعبر عن الاستشعار الحيوي LV-G1-MitoTimer، ونوع المجهر والأهداف، واختيار الخلايا المناسبة هي متغيرات حاسمة يجب أن تبقى متسقة قدر الإمكان في هذا البروتوكول. كثافة الخلية، ونوع المتجه، والثدي الفيروسي يمكن تكييفها وفقا للسؤال. على الرغم من أن العمل السابق يظهر أن التعبير LV-G1-MitoTimer ليس له عواقب ضارة على وظيفة الميتوكوندريا وديناميات21،22،26،27، فمن الضروري التحقق من أن التركيز ليس ساما للخلايا (على سبيل المثال ، التحقق من العدد الإجمالي للخلايا المسيطرة بشكل جيد). كما يتم استخدام مستوى واحد التنسيق، وينبغي أن تكون الخلايا الفلكية: (1) مسطحة قدر الإمكان، (2) معزولة عن غيرها من الخلايا المسماة (لتبسيط التحليل في حالة التشريد في الطبق)، و (3) امتلاك مستويات عالية من الفلورية. كما يمكن أن تكون الخلايا في الثقافة متغيرة للغاية في مورفولوجيا، يمكن أن يكون نظام الميتوكوندريا غير متجانسة للغاية. وفي هذا السياق، فإن تحليل مؤشرات الاستثمار (وليس الخلية بأكملها) يعوض عن بعض المناطق الإشكالية، مثل المناطق المحيطة بالنوى، ويقلل من التباين. من الضروري القيام خط الأساس على خلايا مشابهة نسبيا وعينة أكبر عدد ممكن من الخلايا. وبالتالي ، فإن مجاهر الحصول على المحتوى العالي والتحليل مناسبة بشكل مثالي. خلال هذا الرصد الطولي، من المهم أيضا عدم تعريض الخلايا للضوء بشكل مفرط لتجنب تبييض الحساس الحيوي.
لا تخلو طريقة التصوير هذه من تعقيداتها ، وفي جميع أنحاء البروتوكول ، يتم تضمين العديد من الملاحظات ، والتي تأخذ في الاعتبار استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي تمت خلال الاختبارات السابقة باستخدام المجهر. على سبيل المثال، اختيار طلاء لوحة المستخدمة يعتمد على المقايسة المقصودة، ولكن تم تضمين توصيات لخيارات أنسب للثقافات الأولية astrocyte. بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء اكتساب الصورة على ما لا يقل عن 5 خلايا لكل حالة بسبب التباين بين الخلايا. وبشكل أكثر تحديدا، فإن بعض الخلايا التي تم اختيارها في التصوير الأساسي سوف تموت، وبعضها سيخرج من إطار منطقة اكتساب الصور المخصصة، وبعضها سيغير مورفولوجياها، مما يجعل من الصعب جدا تخصيص الميتوكوندريا في التحليل. تصوير العديد من الخلايا من البداية تزيد من احتمال وجود حجم عينة كبيرة بما يكفي من الخلايا لتحليل في نهاية التجربة. بالإضافة إلى الجوانب الأكثر تعقيدا لتقنية التصوير هذه ، هناك بعض القيود الصريحة فيما يتعلق بمن يمكنه الاستفادة من هذا النوع من التصوير والتحليل. من أجل الاستفادة الكاملة من أتمتة الحصول على الصورة ، يجب أن يكون المجهر المستخدم نظام التركيز البؤري التلقائي الذي يمكنه التعامل مع سرعة الفواصل الزمنية بين الصور (أي كل 3 ق في هذا البروتوكول) ويمكن أن يركز باستمرار على الخلية المعنية قبل التقاط كل صورة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون برنامج JOBS ، الذي يقوم بأتمتة عملية الحصول على الصورة بأكملها ، تصبح هذه الطريقة شاقة ويحتمل أن تكون مستحيلة اعتمادا على عدد الخلايا التي يتم تصويرها لأنها تتطلب العثور على كل خلية وتصويرها يدويا مرة أخرى في النقطة الزمنية المناسبة. وأخيرا، فإن طريقة التصوير هذه ليست محصنة ضد مسألة الbleaching الضوئي. لهذا السبب ، كما هو الحال مع أي طريقة اقتناء طويلة الأجل ، من المهم اختيار علامات الفلورسنت الأقل عرضة للbleaching وتصميم الحصول على الصورة لتجنب هذه المشكلة قدر الإمكان.
تختلف هذه التقنية عن التقنيات الأخرى المستخدمة حاليا بطريقة حاسمة. على عكس دراسات الفاصل الزمني الأخرى ، لا تتطلب هذه التقنية التصوير على نفس الوضع في البئر طوال الوقت ، ولا تتطلب حركة يدوية للوح لتصوير مناطق أخرى. وهذا يسمح للباحثين القدرة على تصوير العديد من الخلايا في العديد من الظروف في إطار زمني واحد 24 ساعة. وبالتالي، فإن القدرة على إجراء هذا التصوير والتحليل على العديد من الخلايا في كل بئر تعطي نفس المعلومات السكانية التي يمكن للمرء الحصول عليها من دراسة مجموعة كبيرة من الخلايا على نطاق واسع مع توفير تدابير محددة إضافية من كل خلية مصورة. في حين أن بعض الخصائص لهذه الطريقة قد لا تنطبق على أساليب أخرى لاكتساب الصور (المبينة أعلاه) ، فإن الفوائد تفوق المضاعفات مع نوع التحليل الممكن بعد الاستحواذ. تسمح هذه التقنية للباحثين برؤية التداعيات الدقيقة للعلاجات المختلفة على نظام الميتوكوندريا ، وبالتالي ، على الخلايا الفلكية المستزرعة.
بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة قابلة للتخصيص بشكل كبير للعديد من الأسئلة العلمية المختلفة المتعلقة بسلوك الميتوكوندريا وأدوارها في سياقات محددة. هنا يتناول البروتوكول المحدد على وجه التحديد مع الخلايا الفلكية المثقفة. ومع ذلك، يمكن استخدام العديد من أنواع الخلايا الأخرى، والعلاجات التي يمكن اختبارها محدودة فقط من خلال الأسئلة التي يتم التحقيق فيها. هذا النوع من التصوير لديه القدرة على تعزيز المعرفة الجماعية وفهم سلوك الميتوكوندريا ، والآليات الأساسية التي تؤدي إلى خلل الميتوكوندريا ، وآثار العديد من الأمراض على الديناميات الفطرية الموجودة في أنواع مختلفة من الخلايا.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال زمالة مؤسسة Synapsis الممنوحة ل K.R. ومستشفى جامعة لوزان (CHUV). الكتاب أشكر نيكون لمساعدتهم ، ولا سيما J. Gannevat.
Materials
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neurosciences. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. “Fluorescent timer”: Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
