I corpi cellulari delle afferenze vagali sono contenuti nei gangli giugulari, petrosali e nodosi^1,2,3. I loro assoni viaggiano insieme attraverso diversi rami del nervo vago ai territori craniocervicale, toracico e addominale^4,5,6,7. Dalle loro terminazioni viscerali, le afferenze vagali possono rispondere a una vasta gamma di stimoli fisiologici e nocivi^8,9,10. Tuttavia, la distribuzione delle molecole di segnalazione e dei recettori coinvolti nel rilevamento vagale rimane scarsamente caratterizzata. Ciò è in parte dovuto al fatto che i gangli vagali, nonostante le loro piccole dimensioni, esprimono un ampio spettro di recettori, tra cui un gran numero di GPCR^8,11,12,13. Inoltre, i neuroni afferenti vagali sono intrinsecamente eterogenei e mostrano profili molecolari distinti¹⁴. A complicare la questione, i gangli giugulari, petrosali e nodosi sono attaccati al topo, formando così una singola massa gangliare. Infine, in un sottogruppo di animali, il ganglio nodoso è attaccato al ganglio cervicale superiore simpatico¹⁵.

In passato, i ricercatori si sono rivolti all’immunoistochimica per studiare la composizione neurochimica dei neuroni afferenti vagali^16,17,18. Mentre l’immunoistochimica che utilizza anticorpi convalidati è utile, i risultati degli studi immunoistochimici devono essere interpretati con cautela. Ad esempio, numerosi sforzi per identificare anticorpi specifici contro i GPCR hanno fallito^{19,20,21,22,23,24,25,}portando gli investigatori a concludere che la maggior parte degli anticorpi contro i GPCR sono inaffidabili. Per aggirare questi problemi, la PCR quantitativa (qPCR) è stata ampiamente utilizzata per valutare l’espressione genica nel roditore vagale di massa gangliare^26,27,28,29. Tuttavia, l’esame dell’espressione genica utilizzando la qPCR avviene al costo di una perdita di informazioni spaziali. In particolare, non è possibile prevedere quante cellule o quali tipi di cellule esprimono un particolare gene di interesse (ad esempio, nodosi vs cellule giugulari). I problemi ricorrenti includono anche la contaminazione con i tessuti adiacenti e l’inclusione di lunghezze variabili del nervo vago, gangli cervicali e giugulari superiori durante la dissezione¹⁵. Come risultato delle difficoltà di cui sopra, la controversia circonda l’espressione e la distribuzione di diversi GPCR nei neuroni afferenti vagali. Un esempio particolarmente sconcertante riguarda il recettore della grelina (Ghsr). Mentre alcuni studi hanno trovato un’espressione diffusa di questo recettore nei neuroni afferenti vagali^30,31,32,altri hanno trovato l’mRNA di Ghsr quasi non rilevabile nel ganglio nodoso^11,14. È quindi necessaria una mappatura dettagliata dell’mRNA di Ghsr nella massa gangliare vagale.

L’ibridazione in situ (ISH) è stata utilizzata anche per valutare i modelli di espressione genica nella massa gangliare vagale^{7,11, 12,33,34,35.} Poiché le tecniche basate sull’RNA rimangono più affidabili e specifiche rispetto alle tecniche basate sugli anticorpi nella maggior parte delle circostanze^36,37,gli studi ISH si sono dimostrati preziosi per una migliore comprensione della codifica neurochimica dei neuroni afferenti vagali. Tuttavia, le stesse tecniche ISH tradizionali non sono prive di avvertimenti. L’ISH radioattivo è sensibile ma genera sfondo e rimane ingombrante³⁸. L’ISH non radioattivo è meno complicato ma anche meno sensibile³⁸. Al contrario, il metodo RNAscope ISH recentemente sviluppato è altamente sensibile e genera uno sfondo minimo³⁹. L’attuale studio ha applicato l’RNAscopio fluorescente multiplex al rilevamento di GPCR nei neuroni afferenti vagali del topo. Ci siamo concentrati sulla mappatura della distribuzione di Ghsr e abbiamo confrontato la sua distribuzione con quella del recettore colecistochinina (Cck1r), un altro GPCR ben noto per essere espresso nel ganglio nodoso³⁴. Infine, i due fattori di trascrizione, l’omeobox 2b accoppiato (Phox2b) e la proteina 12 del dito di zinco del dominio PR (Prdm12), sono stati utilizzati come marcatori selettivi per i neuroni afferenti nodosi e giugulari, rispettivamente¹⁴. Senza visualizzare Phox2b o Prdm12, sarebbe difficile identificare con certezza le afferenze giugulari vs nodosi. Potenziali insidie tecniche sono anche discusse in tutto l’articolo.