Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung
Summary
Multiplex in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet, um gleichzeitig die Transkripte für zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und einen Transkriptionsfaktor im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu visualisieren. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um genaue Karten der Transkriptionsprofile von vagalen afferenten Neuronen zu erstellen.
Abstract
Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die Multiplex-in-situ-Hybridisierung (ISH) der Maus-Jugular-Nodose-Ganglien, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Nachweis der Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Formalin-fixierte Jugular-Nodose-Ganglien wurden mit der RNAscope-Technologie verarbeitet, um gleichzeitig die Expression von zwei repräsentativen GPCRs (Cholecystokinin- und Ghrelin-Rezeptoren) in Kombination mit einem Markergen entweder der Nodose (paarartige Homöobox 2b, Phox2b) oder jugularen afferenten Neuronen (PR-Domäne Zinkfingerprotein 12, Prdm12) nachzuweisen. Markierte Ganglien wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Verteilungs- und Expressionsmuster der oben genannten Transkripte zu bestimmen. Kurz gesagt, phox2b afferente Neuronen wurden gefunden, um reichlich den Cholecystokinin-Rezeptor (Cck1r) zu exprimieren, aber nicht den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Es wurde auch festgestellt, dass eine kleine Untergruppe von Prdm12-afferenten Neuronen Ghsr und / oder Cck1r exprimiert. Der in diesem Artikel beschriebene Ansatz kann Wissenschaftlern helfen, genaue Karten der Transkriptionsprofile vagaler afferenter Neuronen zu erstellen.
Introduction
Die Zellkörper der vagalen Afferenzen sind in den Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien1,2,3enthalten. Ihre Axone wandern zusammen über mehrere Äste des Vagusnervs zu den kraniozervikalen, thorakalen und abdominalen Territorien4,5,6,7. Von ihren viszeralen Enden aus können vagale Afferenzen auf eine Breite von physiologischen und schädlichen Reizen reagieren8,9,10. Die Verteilung von Signalmolekülen und Rezeptoren, die an der Vaguserfassung beteiligt sind, ist jedoch nach wie vor schlecht charakterisiert. Dies liegt zum Teil daran, dass die Vagusganglien trotz ihrer geringen Größe ein breites Spektrum von Rezeptoren exprimieren, darunter eine große Anzahl von GPCRs8,11,12,13. Darüber hinaus sind vagale afferente Neuronen von Natur aus heterogen und weisen unterschiedliche molekulare Profile auf14. Um die Sache zu komplizieren, sind die Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien in der Maus befestigt und bilden dadurch eine einzige ganglionäre Masse. Schließlich ist bei einer Untergruppe von Tieren das Knotenganglion an das sympathische Ganglion cervicalis superior15gebunden.
In der Vergangenheit haben sich die Forscher der Immunhistochemie zugewandt, um die neurochemische Zusammensetzung der vagalen afferenten Neuronen zu untersuchen16,17,18. Während die Immunhistochemie mit validierten Antikörpern nützlich ist, müssen die Ergebnisse immunhistochemischer Studien mit Vorsicht interpretiert werden. Zum Beispiel sind zahlreiche Bemühungen, spezifische Antikörper gegen GPCRs zuidentifizieren,gescheitert 19,20,21,22,23,24,25, was die Forscher zu dem Schluss führte, dass die Mehrheit der Antikörper gegen GPCRs unzuverlässig ist. Um diese Probleme zu umgehen, wurde die quantitative PCR (qPCR) weit verbreitet zur Beurteilung der Genexpression in der vagalen Ganglionmasse des Nagetiers26,27,28,29. Die Untersuchung der Genexpression mittels qPCR erfolgt jedoch auf Kosten eines Verlusts räumlicher Informationen. Insbesondere kann nicht vorhergesagt werden, wie viele Zellen oder welche Zelltypen ein bestimmtes Gen von Interesse exprimieren (z. B. Schlinge vs. Jugularzellen). Zu den wiederkehrenden Problemen gehören auch die Kontamination mit benachbarten Geweben und die Einbeziehung variabler Längen des Vagusnervs, des oberen Gebärmutterhalses und der Jugularganglien während der Dissektion15. Infolge der oben genannten Schwierigkeiten gibt es Kontroversen um die Expression und Verteilung mehrerer GPCRs in vagalen afferenten Neuronen. Ein besonders rätselhaftes Beispiel betrifft den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Während einige Studien eine weit verbreitete Expression dieses Rezeptors in vagalen afferenten Neuronen30,31,32gefunden haben, haben andere festgestellt, dass Ghsr mRNA im Nodose Ganglion11,14fast nicht nachweisbar ist . Eine detaillierte Kartierung der Ghsr-mRNA in der vagalen ganglionären Masse ist daher gerechtfertigt.
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) wurde auch verwendet, um Genexpressionsmuster in der vagalen ganglionären Masse7,11,12,33,34,35zubewerten. Da RNA-basierte Techniken unter den meisten Umständen zuverlässiger und spezifischer bleiben als Antikörper-basierte Techniken36,37, ISH-Studien haben sich als wertvoll für ein besseres Verständnis der neurochemischen Kodierung von vagalen afferenten Neuronen erwiesen. Nichtsdestotrotz sind traditionelle ISH-Techniken selbst nicht ohne Vorbehalte. Radioaktives ISH ist empfindlich, erzeugt aber Hintergrund und bleibt umständlich38. Nicht-radioaktive ISH ist weniger kompliziert, aber auch weniger empfindlich38. Im Gegensatz dazu ist die kürzlich entwickelte RNAscope ISH-Methode hochempfindlich und erzeugt minimalen Hintergrund39. Die aktuelle Studie wandte multiplex fluoreszierendes RNAscope zum Nachweis von GPCRs in vagalen afferenten Neuronen der Maus an. Wir konzentrierten uns auf die Kartierung der Verteilung von Ghsr und verglichen seine Verteilung mit der des Cholecystokinin-Rezeptors (Cck1r), einer anderen GPCR, von der bekannt ist, dass sie im Knotenganglion34exprimiert wird. Schließlich wurden die beiden Transkriptionsfaktoren, die paarartige Homöobox 2b (Phox2b) und das PR-Domänen-Zinkfingerprotein 12 (Prdm12), als selektive Marker für nodose und jugular afferente Neuronen verwendet14. Ohne die Visualisierung von Phox2b oder Prdm12 wäre es schwierig, Jugular vs. Nodose Afferents mit Sicherheit zu identifizieren. Mögliche technische Fallstricke werden ebenfalls im gesamten Artikel diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Technik der ISH wurde in den späten 1960er Jahren erfunden42. Erst Mitte der 1980er Jahre wurde es jedoch zum Nachweis von mRNAs im zentralen und peripheren Nervensystem eingesetzt43,44. In Anbetracht der Heterogenität des Nervensystems und wiederkehrender Probleme mit Antikörpern bleibt die Lokalisierung eines bestimmten Transkripts auf zellulärer Ebene ein unschätzbares Werkzeug. Dennoch sind die traditionellen ISH-Methoden müh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core unterstützt, der durch den NIH-Zuschuss #5P01DK119130-02 finanziert wurde. Die Autoren möchten die Unterstützung der UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (unter der Leitung von Dr. Phelps) und ihrer Mitarbeiter (Abhijit Bugde und Marcel Mettlen) würdigen, die zum Teil durch den NIH Grant #1S10OD021684-01, eine gemeinsame Ressource des Harold C. Simmons Cancer Center, unterstützt zum Teil durch einen NCI Cancer Center Support Grant, unterstützt wird. P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neurosciences. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
