选择性清洁野生 卡诺菌线 虫以富集肠道微生物组细菌

1. 诱导NGM板上野生线虫的dauer形成 在获得具有不可培养的感兴趣的微生物的蠕虫后，以OP50-1大肠杆菌为食物来源的标准NGM板上培养野生Caenorhabditis菌株。将线虫在20°C孵育。注意：生长 线虫Caenorhabditis 的标准温度在15-25°C之间，但应根据经验确定，以防止感兴趣的微生物的损失。 将动物板在20°C下饿死4-5天，直到所有OP50-1都被消耗掉，并且大多数已经达到dauer阶段。注意：Dauers是长寿的幼虫，由于缺乏营养而发育，并具有保护性角质层。 2. 清洗线虫 将5 mL M9微盐培养基（42 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，8.6 mM NaCl，19 mM NH4Cl）加入6cm饥饿蠕虫板中。 使用无菌玻璃移液器和灯泡，从板中移出M9和蠕虫，并将其转移到无菌的15 mL离心管中。 使用临床离心机，在室温下以1000× g 旋转管中的蠕虫30秒。 使用无菌的15 mL移液器，除去并丢弃蠕虫颗粒上方的M9上清液。不要通过在蠕虫上方留下约50μLM9来干扰管底部的活蠕虫。 将10毫升M9 + 0.05%的Triton X-100加入同一离心管中，并充分拧紧试管的盖子。 在室温下将管子在螺母上孵育20分钟以除去外部微生物。从螺母器中取出管子，以1000 x g 的速度旋转蠕虫30秒。 使用无菌移液器，取出并丢弃蠕虫沉淀上方的M9上清液。不要通过在蠕虫上方留下约50μLM9来干扰管底部的活蠕虫。 按照步骤 2.5-2.8 再重复三次。 3. 线虫消毒 通过加入0.25%SDS（250μL10%SDS），50μg/ mL羧苄青素，25μg/ mL卡那霉素，12.5μg/ mL四环素，100μg/ mL庆大霉素，50μg/ mL链霉素，37.5μg/ mL氯霉素和200μg/ mL头孢噻肟，在10mL M9缓冲液中制备抗生素和SDS溶液（见 材料表）。 将含有线虫的管子在抗生素和SDS溶液中孵育在室温下在螺母上过夜。注意：所有非dauer蠕虫和胚胎都会死亡，但许多dauer蠕虫将在此清洁过程中存活下来。 4. 去除抗生素和SDS溶液 在室温下以1000 x g 旋转管中的蠕虫1分钟。使用无菌移液器，从离心管中取出上清液，而不会干扰离心管底部的蠕虫。 加入 10 mL M9 + 0.05% Triton X-100，并充分拧紧管盖。在室温下将管在螺母器上孵育20分钟。 从螺母器中取出管子，以1000 x g 旋转蠕虫1分钟。按照步骤 4.2-4.3 重复三次。 最后一次洗涤后，将蠕虫沉淀在100μL溶液的底部不受干扰，并丢弃其余部分。 5. 繁殖干净的线虫菌株 使用无菌玻璃移液器，将100μL上清液和沉淀转移到用OP50-1接种的10cm NGM板的中心。让板干燥，而不会干扰中心的液体。 让dauers爬出中心并通过OP50-1草坪5-10分钟。 小心地拿起一个dauer，然后将其装在6厘米的NGM种子盘上。总共，至少挑选10个dauers，并将它们装在单独的6厘米NGM板中，用OP50-1播种（总共10个板）。 将板在20°C下孵育4-5天，直到dauers生长并且下一代（F1）达到成虫阶段。目视检查所有板上的污染，被视为非OP50-1微生物生长。 对于每个干净的板， 通过 Normarski或荧光显微镜验证目标微生物的传播，例如荧光 原位 杂交（FISH）12，具体取决于感兴趣的表型。 6. 微生物种类的肠道解剖和PCR鉴定 在20°C下培养动物3-4天，使它们挨饿并减少OP50-1细菌的数量。将5 mL M9培养基加入饥饿蠕虫的板中。 使用无菌玻璃移液器和灯泡，从板中移取M9 +蠕虫，并将其转移到无菌的15 mL离心管中。 使用临床离心机，在室温下以1000× g 旋转管中的蠕虫30秒。 使用无菌的15 mL移液管，从离心管中取出上清液，而不会干扰管底部的活虫。 加入10 mL M9 + 0.05%Triton X-100，并将试管在螺母上孵育20分钟以除去外部微生物。重复四次以清洗蠕虫。 在最后一次洗涤后，使用无菌移液器尖端，在100μL溶液中除去上清液而不干扰底部的沉淀。 使用无菌移液器吸头，将M9和蠕虫转移到未播种的NGM板中，让板干燥，而蠕虫四处爬行20分钟，以帮助从角质层和肠道中去除OP50-1。 将250μLM9加入干燥的板中，并使用玻璃移液器将M9 +蠕虫转移到新的未播种的NGM板中。同样，让盘子干燥，让蠕虫爬来爬去20分钟。 向板中加入250 μL M9，并将100 μL M9 +蠕虫转移到干净的手表玻璃杯中。 使用两根无菌的26 G注射器针头，用一根针将蠕虫压在下面，用另一根针头切断蠕虫，从而斩首线虫。斩首后，肠道（颗粒状）和性腺（透明）从体内自然出来。 通过用一根针按住肠并用另一根针切开它来切掉暴露的肠子。注意：如果可能，请使用Normarski显微镜，FISH或免疫组织化学验证感兴趣的微生物是否仍然存在于被刺穿的肠道中23。 将单个解剖的肠转移到含有10μL无菌水的0.5mL PCR管中。重复至少5个含有来自不同动物的肠道的PCR管。 将PCR管在-80°C下冷冻至少5分钟。从冰箱中取出PCR管并解冻样品。 上下移液几次，将细菌从肠道中分离出来。 根据可疑的微生物类型，使用通用引物对对细菌、酵母或微孢子虫的小核糖体亚基的 DNA 序列进行 PCR。注意：例如，使用通用细菌16S引物的样品方案如 表1所示。 使用基于过滤器的DNA清洁和浓缩试剂盒纯化扩增子（ 见材料表）并进行Sanger测序。