In situ Hybridisatie in zebravislarven en juvenielen tijdens mesonephrosontwikkeling
Summary
De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.
Abstract
De zebravis vormt tijdens zijn leven twee nierstructuren. De pronephros (embryonale nier) vormt zich tijdens de embryonale ontwikkeling en begint te functioneren op 2 dagen na de bevruchting. De pronephros bestaat uit slechts twee nefronen en dient als enige nier tijdens het larvale leven totdat er meer nierfunctie nodig is vanwege de toenemende lichaamsmassa. Om aan deze hogere vraag te voldoen, begint de mesonephros (volwassen nier) zich te vormen tijdens metamorfose. De nieuwe primaire nefronen versmelten met de pronephros en vormen verbonden lumen. Vervolgens fuseren secundaire nefronen met primaire (enzovoort) om een vertakkend netwerk in de mesonephros te creëren. Het overgrote deel van het onderzoek is gericht op de pronephros vanwege het gemak van het gebruik van embryo’s. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van technieken om oudere en grotere larven en jonge vissen te bestuderen om de ontwikkeling van mesonephros beter te begrijpen. Hier is een in situ hybridisatieprotocol voor genexpressieanalyse geoptimaliseerd voor sondepenetratie, wassen van sondes en antilichamen en bleken van pigmenten om de mesonephros beter te visualiseren. De Tg(lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt om voorlopercellen en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Dit protocol vult een leemte in mesonephros-onderzoek. Het is een cruciaal model om te begrijpen hoe nieuwe nierweefsels zich vormen en integreren met bestaande nefronen en inzichten bieden in regeneratieve therapieën.
Introduction
Het zebravisembryo is een belangrijk model voor het bestuderen van weefselontwikkeling vanwege zijn kleine omvang, transparantie, beschikbare hulpmiddelen en overleving zonder voeding gedurende maximaal vijf dagen1,2. Het heeft sterk bijgedragen aan het begrip van nierontwikkeling en het behoud tussen zebravissen en zoogdieren3,4,5. De nier speelt een essentiële rol bij het handhaven van vloeibare homeostase, het filteren van het bloed en het uitscheiden van afval6. Het nefron, de functionele eenheid van de nier, bestaat uit een bloedfilter dat is verbonden met een lange buis. Bij zebravissen vormen zich gedurende zijn hele leven twee nierstructuren. De pronephros (de tijdelijke embryonale nier) vormt zich het eerst tijdens de vroege ontwikkeling. Het bestaat uit twee nefronen die langs de voorste-achterste as lopen en wordt functioneel rond 2 dagen na de bevruchting (dpf). Het nut van de pronephros ligt in zijn eenvoud, met slechts twee nefronen die meestal lineair en gemakkelijk te visualiseren zijn (hoewel de proximale ingewikkelde tubulus begint te spoelen bij drie dpf)3. Dit heeft niet alleen studies van de vroege ontwikkeling van het intermediaire mesoderm vergemakkelijkt, maar ook het segmentatiepatroon en tubulusherstel7,8.
Het nut van zebravissen wordt beperkt na vijf dpf, wanneer de dooier wordt verminderd en de larven afhankelijk zijn van voeding in het aquatische systeem9. Op ongeveer 2 weken oud ondergaan de larven een metamorfose tot juvenielen, waarbij nieuwe weefsels ontstaan en oude weefsels verloren gaan en/of gereorganiseerd worden9. Dit is ook wanneer de mesonephros (de permanente volwassen nier) zich vormt10,11,12. Het eerste volwassen nefron vormt zich in de buurt van de zesde somiet en versmelt met de distale vroege tubulus van de pronephros. Extra nefronen worden in eerste instantie aan deze positie toegevoegd, maar later ook naar de voorste. De primaire nefronen in deze eerste golf fuseren met de tubuli van de pronephros en delen een gemeenschappelijk lumen om hun afval af te zetten. Secundaire nefronen vormen zich in de volgende golf en fuseren met primaire nefronen. Dit reiteratieve proces creëert een mesonephros die vertakt is, enigszins verwant aan de zoogdiernier. Vermoedelijk verliest de pronephros uiteindelijk zijn tubulusidentiteit en worden het twee grote verzamelkanalen waar alle nefronen hun afval afvoeren13.
Voorafgaand aan de vorming van het eerste volwassen nefron, beginnen enkelvoudige voorlopercellen te verschijnen in larven van ~ 4 mm (totale lengte) (~ 10 dpf). Deze cellen, die zijn gemarkeerd in de Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn, hechten zich aan de pronephros en lijken te migreren naar toekomstige plaatsen van nefroese. De afzonderlijke cellen smelten samen tot clusters, die differentiëren tot nieuwe nefronen12. Het is onduidelijk waar deze cellen zich bevinden of welke genen ze tot expressie brengen vóór het begin van mesonefogenese.
Inzicht in de ontwikkeling van mesonephros geeft inzicht in de nier van zoogdieren op manieren die de pronephros niet kunnen. Deze omvatten de vorming van nefrogene aggregaten uit cellen met één voorloper, functionele integratie van nieuwe nefronen met bestaande en vertakkende morfogenese. Er zijn echter beperkingen aan het bestuderen van postembryonische ontwikkeling. De larven zijn minder transparant vanwege hun grotere formaat en pigmentatie. De ontwikkelingstijdlijn loopt niet synchroon tussen individuele dieren en is sterk afhankelijk van omgevingsfactoren, zoals voeding en drukte9,14. Hoewel knockdown-reagentia bestaan, zijn ze minder effectief in larven in vergelijking met embryo’s15. In dit protocol wordt een in situ hybridisatiemethode beschreven om genexpressie te bepalen tijdens de ontwikkeling van mesonephros van zebravissen. Verschillende stappen zijn geoptimaliseerd om de visualisatie van de mesonephros en de penetratie en het wassen van de sonde en het antilichaam te vergroten. De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt samen met een sonde voor EGFP om enkele voorlopercellen, nefrogene aggregaten en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Deze methode zal een dieper inzicht geven in de ontwikkeling van mesonephros en inzicht geven in regeneratieve therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven in situ hybridisatiemethode is gericht op het bestuderen van de ontwikkeling van mesonephros. Het kan echter worden toegepast om de ontwikkeling van andere weefsels en organen tijdens metamorfose te bestuderen, zoals de darm, het zenuwstelsel, schubben en pigmentatie14. Probes kunnen worden gegenereerd voor endogene genen of fluorescerende markers in transgene lijnen.
Het is van cruciaal belang dat de larven intact blijven om de organen en we…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering werd verstrekt door de Pennsylvania Academy of Science, en het Gemenebest van Pennsylvania Biologen, en de Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, en het Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn werd geleverd door Dr. Neil Hukriede (Universiteit van Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologie du développement. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
