Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.
De rollen en connectiviteit van specifieke soorten neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg (DH) worden in een snel tempo afgebakend om een steeds gedetailleerder beeld te geven van de circuits die ten grondslag liggen aan de verwerking van spinale pijn. De effecten van deze verbindingen voor bredere netwerkactiviteit in de DH blijven echter minder goed begrepen omdat de meeste studies zich richten op de activiteit van enkele neuronen en kleine microcircuits. Als alternatief biedt het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA’s), die de elektrische activiteit in veel cellen kunnen volgen, een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van neurale activiteit. Hier wordt het gebruik van MEA’s met muisplakken van het ruggenmerg beschreven om DH-activiteit te bestuderen die wordt geïnduceerd door chemisch stimulerende DH-circuits met 4-aminopyridine (4-AP). De resulterende ritmische activiteit is beperkt tot de oppervlakkige DH, stabiel in de tijd, geblokkeerd door tetrodotoxine, en kan worden onderzocht in verschillende plakoriëntaties. Samen biedt dit preparaat een platform om dh-circuitactiviteit in weefsel van naïeve dieren, diermodellen van chronische pijn en muizen met een genetisch veranderde nociceptieve functie te onderzoeken. Bovendien kunnen MEA-opnames in 4-AP-gestimuleerde ruggenmergplakken worden gebruikt als een snelle screeningtool om het vermogen van nieuwe antinociceptieve verbindingen te beoordelen om de activiteit in het ruggenmerg DH te verstoren.
De rollen van specifieke soorten remmende en exciterende interneuronen in het ruggenmerg DH worden in een snel tempo blootgelegd 1,2,3,4. Samen vormen interneuronen meer dan 95% van de neuronen in de DH en zijn ze betrokken bij sensorische verwerking, inclusief nociceptie. Bovendien zijn deze interneuroncircuits belangrijk om te bepalen of perifere signalen de neuroaxis opstijgen om de hersenen te bereiken en bijdragen aan de perceptie van pijn 5,6,7. Tot op heden hebben de meeste studies de rol van DH-neuronen op het niveau van analyse van één cel of het hele organisme onderzocht met behulp van combinaties van in vitro intracellulaire elektrofysiologie, neuroanatomische etikettering en in vivo gedragsanalyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Deze benaderingen hebben het begrip van de rol van specifieke neuronpopulaties bij pijnverwerking aanzienlijk verbeterd. Er blijft echter een kloof bestaan in het begrijpen hoe specifieke celtypen en kleine macrocircuits grote populaties neuronen op microcircuitniveau beïnvloeden om vervolgens de output van de DH, gedragsreacties en de pijnervaring vorm te geven.
Een technologie die macrocircuits of meercellige functies kan onderzoeken, is de micro-elektrode array (MEA)15,16. MEAs worden al tientallen jaren gebruikt om de werking van het zenuwstelsel te onderzoeken17,18. In de hersenen hebben ze de studie van neuronale ontwikkeling, synaptische plasticiteit, farmacologische screening en toxiciteitstests vergemakkelijkt17,18. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo toepassingen, afhankelijk van het type MEA. Bovendien is de ontwikkeling van MEA’s snel geëvolueerd, met verschillende elektrodenummers en configuraties die nu beschikbaarzijn 19. Een belangrijk voordeel van MEA’s is hun vermogen om tegelijkertijd elektrische activiteit in veel neuronen te beoordelen met een hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid via meerdere elektroden15,16. Dit biedt een bredere uitlezing van hoe neuronen interageren in circuits en netwerken, onder controleomstandigheden en in de aanwezigheid van lokaal toegepaste verbindingen.
Een uitdaging van in vitro DH-preparaten is dat de voortdurende activiteitsniveaus meestal laag zijn. Hier wordt deze uitdaging aangepakt in DH-circuits van het ruggenmerg met behulp van de voltage-gated K + kanaalblokker, 4-aminopryidine (4-AP), om DH-circuits chemisch te stimuleren. Dit medicijn is eerder gebruikt om ritmische synchrone elektrische activiteit vast te stellen in de DH van acute ruggenmergplakken en onder acute in vivo omstandigheden 20,21,22,23,24. Deze experimenten hebben eencellige patch en extracellulaire opname of calciumbeeldvorming gebruikt om 4-AP-geïnduceerde activiteit 20,21,22,23,24,25 te karakteriseren. Samen heeft dit werk de vereiste aangetoond van exciterende en remmende synaptische transmissie en elektrische synapsen voor ritmische 4-AP-geïnduceerde activiteit. De 4-AP-respons wordt dus gezien als een benadering die inheemse polysynaptische DH-circuits met biologische relevantie ontmaskert in plaats van als een door geneesmiddelen geïnduceerd epifenomeen. Bovendien vertoont 4-AP-geïnduceerde activiteit een vergelijkbaar responsprofiel op analgetische en anti-epileptica als neuropathische pijnaandoeningen en is het gebruikt om nieuwe spinale analgetische medicijndoelen voor te stellen, zoals connexinen 20,21,22.
Hier wordt een preparaat beschreven dat MEAs en chemische activering van de spinale DH combineert met 4-AP om deze nociceptieve circuits op macrocircuit of netwerkniveau van analyse te bestuderen. Deze aanpak biedt een stabiel en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van nociceptieve circuits onder naïeve en neuropathische ‘pijnachtige’ omstandigheden. Deze voorbereiding is ook gemakkelijk toepasbaar om de werking op circuitniveau van bekende analgetica te testen en om nieuwe analgetica in het hyperactieve ruggenmerg te screenen.
Ondanks het belang van de spinale DH bij nociceptieve signalering, verwerking en de resulterende gedrags- en emotionele reacties die pijn kenmerken, blijven de circuits binnen deze regio slecht begrepen. Een belangrijke uitdaging bij het onderzoeken van dit probleem is de diversiteit van neuronpopulaties waaruit deze circuitsbestaan 6,31,32. Recente ontwikkelingen in transgene technologieën, geleid door optogenetica en chemogen…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (subsidies 631000, 1043933, 1144638 en 1184974 aan B.A.G. en R.J.C.) en het Hunter Medical Research Institute (subsidie aan B.A.G. en R.J.C.).
4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
Custom made air interface incubation chamber | |||
Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
MATLAB | MathWorks | R2018b | |
MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |