Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme
Summary
Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.
Abstract
Mitokondriyal Ca2+, sitozolitik Ca2+ arabelleğe alma, enerji metabolizması ve hücresel sinyal transdüksiyonunu kontrol etmede kritik bir rol oynar. Mitokondriyal Ca2+’nın aşırı yüklenmesi, nörolojik hastalıklarda nörodejenerasyon ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlara katkıda bulunur. Burada astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için moleküler yaklaşımı hedefleyen hücre tipi spesifik ve mitokondriler in vitro ve in vivo sunuyoruz. Genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerini (GECI’ler) GCaMP5G veya GCaMP6’ları (GCaMP5G/6s) astrosit ve nörona özgü promotörler gfaABC1D ve CaMKII ve mitokondri hedefleme dizisi (mito-) ile kodlayan DNA plazmidleri inşa ettik. İn vitro mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için plazmidler GCaMP5G/6’ları ifade etmek için kültürlü astrositlerde ve nöronlarda transkripsiyon edildi. In vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için adeno ilişkili viral vektörler (AAV’ ler) hazırlandı ve astrositlerde ve nöronlarda mitokondrilerde GCaMP5G/6’ları ifade etmek için fare beyinlerine enjekte edildi. Yaklaşımımız, astrosit ve nöronlardaki mitokondriyal Ca2+ dinamiklerini, sitosolik ve mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin yanı sıra astrosit-nöron etkileşimleri arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Mitokondriler dinamik hücre altı organellerdir ve enerji üretimi için hücre güç merkezleri olarak kabul edilir. Öte yandan, mitokondriler lokal veya sitozolitik Ca2+ yükselmelerine yanıt olarak Ca2+’yı matrise alabilir. Mitokondriyal Ca2+ alımı, trikarboksilik asit (TCA) döngüsündeki reaksiyonlar ve oksidatif fosforilasyon gibi metabolik süreçler de dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyonu etkiler ve fizyolojik koşullar altında Ca2+duyarlı proteinleri düzenler 1,2,3,4. Mitokondriyal Ca2+ aşırı yükleme, çeşitli beyin bozukluklarında nekroz ve apoptoz da dahil olmak üzere hücre ölümü için de belirleyicidir5,6,7. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (mPTP’ ler) açılmasına ve apoptotik hücre ölümünü başlatan caspase kofaktörün salınmamasına neden olur. Bu nedenle hücresel fizyolojiyi ve patolojiyi daha iyi anlamak için canlı hücrelerde mitokondriyal Ca2+ dinamiklerinin ve elleçlemenin incelenmesi önemlidir.
Mitokondri, Ca2+ alımı ve efflux arasındaki denge ile matris Ca2+ homeostazını korur. Mitokondriyal Ca2+ alımı esas olarak mitokondriyal Ca2+ uniporterler (MCU’ lar) tarafından aracılık edilirken, mitokondriyal Ca2+ efflux Na+-Ca2+-Li+ eşanjörleri (NCLXs) ve H+/ Ca2+ eşanjörleri (mHCXs)8ile aracılık eder. Denge, G-protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) uyarılması yoluyla bozunabilir9. Mitokondriyal Ca2+ homeostaz da çözünmeyen xCa2+-xPO4x-xOH komplekslerinin oluşumu ile mitokondriyal tamponlamadan etkilenir8.
Ca2+ konsantrasyonundaki hücre içi ve mitokondriyal değişiklikler ([Ca2+]) floresan veya lüminesan Ca2+ göstergeleri ile değerlendirilebilir. Göstergelere ca2+ bağlama spektral değişikliklere neden olur ve canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak ücretsiz hücresel [Ca2+] kaydedilmeye izin verir. Hücrelerdeki Ca2+ değişikliklerini izlemek için şu anda iki tür prob mevcuttur: organik kimyasal göstergeler ve genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergeleri (GECI’ler). Genellikle, incelenmektedir biyolojik sorular için farklı Ca2+ benzeşimlerine (Kd’yedayalı), spektral özelliklere (uyarlama ve emisyon dalga boyları), dinamik aralıklara ve hassasiyetlere sahip farklı varyantlar mevcuttur. Sitosolic Ca2+ görüntüleme için birçok sentetik organik Ca2+ göstergesi kullanılmış olsa da, sadece birkaçı mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için mitokondriyal matrise seçici olarak yüklenebilir ve Rhod-2 en yaygın kullanılandır (incelemeler için bkz.10,11). Bununla birlikte, Rhod-2 uzun süreli denemeler sırasında sızıntının büyük bir dezavantajı vardır; ek olarak, mitokondriler, diğer organeller ve sitozol arasında bölünür ve farklı alt bölümlerde mutlak ölçümleri zorlaştırır. Buna karşılık, hücre tipine özgü promotörler ve hücre altı bölme hedefleme dizileri kullanılarak, GECI’ler hücre ve bölmeye özgü Ca2+ görüntüleme in vitro veya in vivo için farklı hücre tiplerinde ve hücre altı bölmelerdeifade edilebilir. Tek dalga boyu floresan yoğunluğuna dayalı GCaMP Ca2+ göstergeleri son zamanlarda majörGECI’ler 12 , 13,14,15,16olarak ortayaçıkmıştır. Bu makalede, astrositlerde ve nöronlarda GCaMP5G ve GCaMP6s’ın (GCaMP5G/6s) mitokondri hedeflemesi ve hücre tipi spesifik ekspresyonu ve bu hücre tiplerinde mitokondriyal Ca2+ alımını görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak, bireysel mitokondrilerde GCaMP6G / 6s ifadesi ortaya çıkarılabilir ve tek mitokondriyal çözünürlükte Ca2 + alımı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda astrosit ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi için bir yöntem ve protokol sunuyoruz. GECI GCaMP5G/6’ları ifade etmek için mitokondri hedefleme ve hücre tipine özgü stratejiler uyguladık. Mitokondrilerde GCaMP5G/6’ları hedeflemek için plazmidlere mitokondri hedefleme dizisi dahil ettik. GCaMP5G/6’ları astrositlerde ve nöronlarda ifadeetmek için in vivo , plazmidlere astrositlere özgü bir promotör gfaABC1D ve nörona özgü promotör CaMKII yerleş…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) tarafından desteklenmiştir R01NS069726 ve R01NS094539 SD’ye hibe eder. Erica DeMers’a ses kaydı için teşekkür ederiz.
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv – European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv – European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neurosciences. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S., Milner, R. . In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
