Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal (TierSchG) y el Reglamento de Animales Experimentales de Bienestar Animal (TierSchVersV) y fueron autorizados por las autoridades locales y los Oficiales de Bienestar Animal de nuestra institución (MDC). 1. Preparación del tejido Prepare una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pocillo para cada riñón que se obtendrá. Prepare una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml de solución de estabilización de ARN por pocillo y riñón. Pre-enfríe ambas placas en hielo. Eutanasia a un ratón macho C57BL/6 de 3 a 6 meses de edad. Coloque el ratón en una bandeja de disección, fije las extremidades y esterilice el abdomen con etanol al 70%. Abra el abdomen hasta la caja torácica con fórceps y tijeras. Levante el intestino y otros órganos hacia un lado y retire los riñones cortando cuidadosamente el uréter, la arteria renal y la vena con una tijera. Lave el riñón en el PBS 1x helado previamente preparado y retire la fascia renal y cualquier grasa restante del riñón hasta que se elimine todo el tejido blanco (Figura 2A). Coloque el riñón en una placa de disección en frío y use un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar para obtener una rebanada media de 1-2 mm. Asegúrese de que la pieza de tejido contenga todo el eje corticomedular (Figura 2B). Use tijeras y pinzas de microdisección para recortar cuidadosamente la corteza desde los lados de la pieza central. Dentro de la pieza de tejido disecado, los tres segmentos de la corteza, la médula externa y la médula interna deben ser claramente visibles (Figura 2C).NOTA: La rebanada no debe exceder un grosor de 2 mm o un peso de 20 mg para garantizar cantidades tampón suficientes para una lisis tisular efectiva y para minimizar el ARN de fondo ambiental en las bibliotecas de ADNc. El ARN ambiental desperdicia la capacidad de secuencia, ya que no está asociado con núcleos individuales. Transfiera la pieza renal a la solución de estabilización de ARN previamente preparada e incube durante 24 h a 4 °C para evitar la degradación del ARN. Después de 24 h, retirar la solución de estabilización de ARN y conservar el tejido a -80 °C hasta su uso posterior. Retire con cuidado el exceso de solución con papel de seda. 2. Aislamiento de núcleos Pasos de limpieza y preparación Limpie las mesas de trabajo y pipetas con etanol al 70% y solución de descontaminación de RNasa. Limpie un tubo de trituradora de tejido de 2 ml de fondo redondo y haga coincidir el mortero A y B con la solución de descontaminación de RNasa, seguido de etanol al 70% y agua libre de RNasa (1 juego de tubos y mortero por muestra). Deja que se seque completamente. Preenfriar la centrífuga a 4 °C. Etiquete y preenfríe tres tubos de recolección de 15 ml, un tubo de recolección de 1.5 ml, un tubo de recolección de 5 ml de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y un tubo de molino seco para cada muestra en hielo. Preparación del tampón Calentar la solución madre del complejo ribonucleósido-vanadilo a 65 °C hasta que se reconstituya a una solución transparente verde-negra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 11 Preparar 1x PBS que contenga 4% de albúmina sérica bovina (BSA) como se describe en la Tabla 1A. Además, prepare 1x PBS con 0.04% BSA (Tabla 1B). Filtrar ambas soluciones con un filtro de jeringa de membrana de acetato de celulosa (SFCA) sin surfactante de 0,2 μm y mantener en hielo hasta su uso posterior. Preparar el tampón de lisis de núcleos 1 (NLB1, Tabla 1C). Añadir 4 ml de tampón de lisis EZ para el tampón de lisis de núcleos 2 (NLB2, Tabla 1D) y 2 ml de BSA/PBS al 0,04 % para el tampón de suspensión de núcleos (NSB, Tabla 1E) a tubos de 15 ml. Agregue la solución inhibidora de RNasa a NLB2 y NSB directamente antes de usarla como se indica a continuación en el protocolo. Mantener en hielo hasta su uso posterior. Prepare el tampón de lisis EZ con sacarosa al 10% (Tampón de gradiente de sacarosa, Tabla 1F). Mezcle bien y filtre el tampón en un tubo fresco de 15 ml utilizando un filtro de jeringa de membrana SFCA de 0,2 μm. Mantener en hielo hasta su uso posterior. Homogeneización tisular y lisis celularNOTA: Para minimizar la degradación del ARN, todos los pasos se llevan a cabo en hielo. El tubo del molinillo, la placa de Petri y todos los tampones deben enfriarse previamente. Todos los pasos de resuspensión se realizan pipeteando cuidadosamente la suspensión de los núcleos. No haga vortex la muestra para evitar las fuerzas de cizallamiento y el daño a los núcleos.Tome la pieza de riñón congelada y transfiérala a una placa de Petri de poliestireno de 60 mm sobre hielo que contenga 1 ml de NLB1. Picar bien el tejido con una cuchilla de afeitar o un bisturí (Figura 3A). Corte la punta de una punta de pipeta de 1 ml y transfiera el tejido picado y el tampón al tubo del molinillo. Asegúrese de transferir todas las piezas de tejido. Lave la placa de Petri 5-10 veces con el tampón, si es necesario. Homogeneice la suspensión en hielo moviendo lentamente el mortero A, 25 veces hacia arriba y hacia abajo en el tubo del molinillo. Evite las burbujas de aire causadas por movimientos rápidos (Figura 3B). Pasar el homogeneizado a través de un filtro de 100 μm en un tubo de recolección de 15 ml preenfriado y lavar el filtro con otro 1 ml de NLB1. Lave el tubo del molinillo con tampón de lisis de núcleos EZ frío y deseche el tampón. Transfiera el homogeneizado de nuevo al tubo del molinillo y homogeneice la suspensión en hielo moviendo lentamente el mortero B, 15 veces hacia arriba y hacia abajo en el tubo del molinillo. Evite las burbujas de aire causadas por movimientos rápidos (Figura 3C). Transfiera el homogeneizado a un tubo de recolección preenfriado de 15 ml. Lave el tubo del molinillo con otros 2 ml de NLB1 y asegúrese de transferir todos los fragmentos de tejido al tubo de recolección. Incubar el homogeneizado (volumen total de 4 mL) durante 5 min en hielo para lisar las células. Purificación de núcleos Pasar el homogeneizado a través de un filtro de 40 μm a un tubo de recolección de 15 ml preenfriado. Girar el tubo de recogida durante 5 min a 500 x g a 4 °C en una centrífuga con un rotor de cuchara oscilante. Mientras tanto, agregue una solución de inhibidor de la RNasa a NLB2 (Tabla 1D). Retire el sobrenadante sin alterar la bolita. Resuspender cuidadosamente el pellet en 4 ml de NLB2. Coloque cuidadosamente la suspensión con un cojín de 1 ml de tampón de gradiente de sacarosa. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga con rotor de cangilón oscilante. Mientras tanto, agregue una solución inhibidora de la RNasa a NSB (Tabla 1E). Después de la centrifugación, retire suavemente el tubo de recolección de la centrífuga y tenga cuidado de no molestar las dos capas cuando manipule el tubo de recolección. Los restos celulares son visibles entre las dos capas. Retire el sobrenadante con cuidado comenzando con los residuos. Retire el sobrenadante restante sin alterar el pellet del núcleo y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 1 ml de NSB.NOTA: El volumen de resuspensión depende de la cantidad de tejido utilizado para el aislamiento y del tamaño del pellet ganado después del último paso de centrifugación. Es posible que sea necesario adaptar el volumen al número esperado de núcleos. Pasar el homogeneizado a través de un filtro de 20 μm en el tubo de recolección FACS de 5 ml preenfriado. 3. Clasificación de núcleos Añadir 20 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por ml de NSB a una concentración final de 2 μM al homogeneizado en el tubo de recogida del FACS y mezclar cuidadosamente. Incubar durante 5 minutos en hielo. Preparar el tubo colector de 1,5 ml preenfriado con 20 μL de BSA al 4% /1x PBS y añadir 0,5 μL de solución inhibidora de la RNasa a una concentración final de 1 U/μL. Proceder inmediatamente a la clasificación. Ordene los núcleos utilizando un clasificador de células.Mezclar brevemente la suspensión de núcleos antes de insertar el tubo de recogida FACS en el clasificador. Establezca una primera puerta P1 basada en la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para excluir escombros y agregados (Figura 4A). Para excluir núcleos vacíos o dañados y múltiplos, establezca una puerta posterior basada en el área DAPI frente a la altura DAPI (DAPI-A vs DAPI-H) (Figura 4B). Clasificar núcleos individuales en el tubo colector de 1,5 ml que contiene BSA al 4% /1x PBS con 1 solución U/μL de inhibidor de la RNasa preparada en 3.2. 4. Control de calidad Mida la concentración final de núcleos bajo un microscopio de fluorescencia o en una cámara de conteo automatizada en al menos dos recuentos independientes y evalúe la calidad de la suspensión (Figura 5).NOTA: Las concentraciones óptimas están entre 700 – 1,200 núcleos / μL. Las concentraciones celulares más bajas, como 700 núcleos / μL, pueden ser preferibles ya que las bibliotecas de ADNc resultantes contenían menos ARN de fondo ambiental (transcripciones no asociadas con núcleos individuales). Calcular el volumen requerido de suspensión de núcleos para la recuperación deseada de núcleos individuales secuenciados. Para evitar la agregación de núcleos y la degradación del ARN, proceda inmediatamente a la preparación de la biblioteca.