Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Wet dierenwelzijn (TierSchG) en de Regeling Dierenwelzijn Proefdieren (TierSchVersV) en zijn geautoriseerd door de lokale autoriteiten en de Animal Welfare Officers van onze instelling (MDC). 1. Weefselvoorbereiding Bereid een 6-well plaat met 2 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) per put voor elke nier die zal worden verkregen. Bereid een 6-well plaat met 2 ml RNA-stabilisatie-oplossing per put en nier. Laat beide borden voorkoelen op ijs. Euthanaseer een 3- tot 6 maanden oude mannelijke C57BL/6 muis. Plaats de muis op een ontleedbak, speld de ledematen vast en steriliseer de buik met 70% ethanol. Open de buik tot aan de ribbenkast met behulp van een tang en een schaar. Til de darm en andere organen opzij en verwijder de nieren door de urineleider, nierslagader en ader voorzichtig met een schaar door te snijden. Was de nier in de eerder bereide, ijskoude 1x PBS en verwijder de nierfascia en eventueel achtergebleven vet uit de nier totdat al het witte weefsel is verwijderd (figuur 2A). Plaats de nier op een koude ontleedplaat en gebruik een scherp scalpel of scheermesje om een middelste plak van 1-2 mm te verkrijgen. Zorg ervoor dat het weefselstuk de volledige corticomedullaire as bevat (figuur 2B). Gebruik een microdissectieschaar en een tang om de cortex voorzichtig vanaf de zijkanten van het middenstuk te knippen. Binnen het ontleedde weefselstuk moeten de drie segmenten cortex, buitenste medulla en binnenste medulla duidelijk zichtbaar zijn (figuur 2C).OPMERKING: De plak mag niet groter zijn dan een dikte van 2 mm of een gewicht van 20 mg om voldoende bufferhoeveelheden te garanderen voor effectieve weefsellyse en om omgevingsachtergrond-RNA in de cDNA-bibliotheken te minimaliseren. Omgevings-RNA verspilt sequentiecapaciteit, omdat het niet geassocieerd is met enkele kernen. Breng het nierstuk over in de eerder bereide RNA-stabilisatieoplossing en incubeer gedurende 24 uur bij 4 °C om RNA-afbraak te voorkomen. Verwijder na 24 uur de RNA-stabilisatieoplossing en bewaar het weefsel bij -80 °C tot verder gebruik. Verwijder de overtollige oplossing voorzichtig met tissuepapier. 2. Kernisolatie Reinigings- en voorbereidingsstappen Reinig tafelbladen en pipetten met 70% ethanol en RNase decontaminatieoplossing. Reinig een 2 ml weefselslijperbuis met ronde bodem en bijpassende stamper A en B met RNase-decontaminatieoplossing, gevolgd door 70% ethanol en RNase-vrij water (1 slijpbuis en stamperset per monster). Laat het volledig drogen. Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Label en voorkoel drie opvangbuizen van 15 ml, een opvangbuis van 1,5 ml, een opvangbuis van 5 ml fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en een droge slijpbuis voor elk monster op ijs. Buffervoorbereiding Verwarm de Ribonucleoside-vanadyl complex stockoplossing tot 65 °C totdat deze volgens de instructies van de fabrikant wordt gereconstitueerd tot een groenzwarte heldere oplossing. 11 Bereid 1x PBS met 4% runderserumalbumine (BSA) zoals beschreven in tabel 1A. Bereid daarnaast 1x PBS voor met 0,04% BSA (tabel 1B). Filtreer beide oplossingen met behulp van een 0,2 μm oppervlakteactieve celluloseacetaat (SFCA) membraanspuitfilter en blijf op ijs tot verder gebruik. Bereid kernlysisbuffer 1 voor (NLB1, tabel 1C). Voeg 4 ml EZ-lysisbuffer voor Nuclei Lysis Buffer 2 (NLB2, tabel 1D) en 2 ml 0,04 % BSA / PBS voor de Nuclei Suspension Buffer (NSB, tabel 1E) toe aan 15 ml buizen. Voeg de RNase-remmeroplossing direct voor gebruik toe aan NLB2 en NSB, zoals hieronder aangegeven in het protocol. Op ijs bewaren tot verder gebruik. Bereid EZ lysis buffer met 10% sucrose (Sucrose Gradient Buffer, Tabel 1F). Meng goed en filtreer de buffer in een verse buis van 15 ml met behulp van een SFCA-membraanspuitfilter van 0,2 μmbraan. Op ijs bewaren tot verder gebruik. Weefselhomogenisatie en cellyseOPMERKING: Om RNA-degradatie te minimaliseren, worden alle stappen op ijs uitgevoerd. De slijpbuis, petrischaal en alle buffers moeten worden voorgekoeld. Alle resuspensiestappen worden uitgevoerd door de kernsuspensie zorgvuldig te pipetteren. Draai het monster niet om schuifkrachten en schade aan kernen te voorkomen.Neem het bevroren nierstuk en breng het over in een 60 mm polystyreen petrischaaltje op ijs met 1 ml NLB1. Hak het weefsel grondig fijn met een scheermesje of scalpel (figuur 3A). Snijd de punt van een pipetpunt van 1 ml af en breng het gehakte weefsel en de buffer over naar de slijpbuis. Zorg ervoor dat u alle weefselstukken overbrengt. Was de petrischaal 5-10 keer met de buffer, indien nodig. Homogeniseer de suspensie op ijs door stamper A langzaam op en neer te bewegen in de slijpbuis. Vermijd luchtbellen veroorzaakt door snelle beweging (figuur 3B). Haal het homogenaat door een zeef van 100 μm in een voorgekoelde opvangbuis van 15 ml en was het filter met nog eens 1 ml NLB1. Was de slijpbuis met koude EZ nuclei lysis buffer en gooi de buffer weg. Breng het homogenaat terug in de slijpbuis en homogeniseer de suspensie op ijs door stamper B langzaam te bewegen, 15x op en neer in de slijpbuis. Vermijd luchtbellen veroorzaakt door snelle beweging (figuur 3C). Breng het homogenaat over in een voorgekoelde opvangbuis van 15 ml. Was de slijpbuis met nog eens 2 ml NLB1 en zorg ervoor dat u alle weefselfragmenten overbrengt naar de opvangbuis. Incubeer het homogenaat (totaal volume van 4 ml) gedurende 5 minuten op ijs om de cellen te lyseren. Kernzuivering Breng het homogenaat door een zeef van 40 μm in een voorgekoelde opvangbuis van 15 ml. Draai de opvangbuis gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C in een centrifuge met een rotor met draaibak. Voeg in de tussentijd RNase-remmeroplossing toe aan NLB2 (tabel 1D). Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspensie van de pellet voorzichtig in 4 ml NLB2. Onderleg de suspensie voorzichtig met een 1 ml kussen van Sucrose Gradient Buffer. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een centrifuge met een rotor met draaibak. Voeg in de tussentijd RNase-remmeroplossing toe aan NSB (tabel 1E). Verwijder na het centrifugeren voorzichtig de opvangbuis uit de centrifuge en zorg ervoor dat u de twee lagen niet verstoort bij het hanteren van de opvangbuis. Celresten zijn zichtbaar tussen de twee lagen. Verwijder het supernatant voorzichtig, te beginnen met het vuil. Verwijder het resterende supernatant zonder de kernpellet te verstoren en resuspensie de pellet voorzichtig in 1 ml NSB.OPMERKING: Het resuspensievolume is afhankelijk van de hoeveelheid weefsel die wordt gebruikt voor de isolatie en de pelletgrootte die is verkregen na de laatste centrifugatiestap. Het volume moet mogelijk worden aangepast aan het verwachte aantal kernen. Breng het homogenaat door een zeef van 20 μm in de voorgekoelde 5 ml FACS-opvangbuis. 3. Sorteren van kernen Voeg 20 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) per ml NSB toe aan een eindconcentratie van 2 μM aan het homogenaat in de FACS-opvangbuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Bereid de voorgekoelde opvangbuis van 1,5 ml voor met 20 μL 4% BSA /1x PBS en voeg 0,5 μL RNaseremmeroplossing toe aan een eindconcentratie van 1 U/μL. Ga onmiddellijk verder met sorteren. Sorteer de kernen met behulp van een celsorteerder.Meng de kernsuspensie kort voordat u de FACS-opvangbuis in de sorteerder steekt. Stel een eerste poort P1 in op basis van de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) om puin en aggregaten uit te sluiten (figuur 4A). Om lege of beschadigde kernen en veelvouden uit te sluiten, stelt u een volgende poort in op basis van het DAPI-gebied versus DAPI-hoogte (DAPI-A versus DAPI-H) (figuur 4B). Sorteer enkele kernen in de 1,5 ml opvangbuis met 4% BSA /1x PBS met 1 U/μL RNaseremmeroplossing bereid in 3.2. 4. Kwaliteitscontrole Meet de uiteindelijke kernconcentratie onder een fluorescentiemicroscoop of in een geautomatiseerde telkamer in ten minste twee onafhankelijke tellingen en beoordeel de suspensiekwaliteit (figuur 5).OPMERKING: Optimale concentraties liggen tussen 700 – 1.200 kernen / μL. Lagere celconcentraties zoals 700 kernen / μL kunnen de voorkeur hebben omdat resulterende cDNA-bibliotheken minder omringend achtergrond-RNA bevatten (transcripten die niet geassocieerd zijn met individuele kernen). Bereken het vereiste volume kernsuspensie voor het gewenste herstel van gesequencede enkele kernen. Om nuclei-aggregatie en RNA-degradatie te voorkomen, gaat u onmiddellijk over tot bibliotheekvoorbereiding.