ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה
Summary
אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .
Abstract
Drosophila melanogaster מייצג מודל מתיחה גנטית לחקר מבנה עצבי ותפקוד, ושינויים הבאים במצבי המחלה. צומת נוירו-שרירי זחל מאופיין היטב משמש לעתים קרובות עבור מחקרים כאלה. עם זאת, התפתחות זחל מהירה ואחריה היסטוליזה שרירית ושיפוץ מערכת העצבים במהלך מטמורפוזה עושה מודל זה בעייתי לחקר שינויים ניווניים תלויי גיל איטיים כמו אלה המתרחשים בטרשת אמיוטרופית לרוחב. לחלופין, זבובים בוגרים חיים במשך 90 יום ואת הרגל הבוגרת ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים נוירון מוטורי במהלך תוחלת החיים למבוגרים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית vivo דרך הקיטור. כאן, אנו מתארים טכניקת ניתוח רגליים בשילוב עם אימונוציטוכימיה, המאפשרת לחקור שינויים מולקולריים בצומת הנוירו-שרירי של נוירונים מוטוריים מוטוריים של רגל בוגרת מזוהים. טכניקות אלה ניתן יחד עם מספר עצום של נוגדנים תיוג מבנים טרום ופוסט סינפטי. יחד נהלים אלה מאפשרים אפיון מלא יותר של שינויים תלויי גיל איטיים בזבובים בוגרים וניתן ליישם אותם על פני מודלים מרובים של מחלות נוירונים מוטוריים.
Introduction
מחלות נוירון מוטורי (MN) מקיפות קבוצה של תנאים הטרוגניים הכוללים ניוון מתקדם המוביל לבזבוז שרירים ושיתוק כמו פנוטיפ קליני ראשוני1. למרות נדיר עם שכיחות עולמית של 4.5 לכל 100,000, שכיחות זו צפויה לגדול עם אוכלוסייה מזדקנת2. טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא מחלת ה- MN הנפוצה ביותר (MND) והיא בדרך כלל קטלנית תוך זמן קצר מהאבחון ללא טיפולים קיימים לשינוי מחלות זמינים3. MNDs חולקים במשותף שלב פרזימפטומטי ממושך עם שינויים מוקדמים בסמן ביולוגי מולקולרי ושינויי הדמיה פונקציונליים שנראו בחולים4. פתולוגיה תאית פרזימפטומטית מוקדמת נצפתה גם במודלים של מחלות לא אנושיות5,6,7,8. המחקר של שינויים מוקדמים בצומת neuromuscular חשוב להבנת פתוגנזה מחלת MN ועשוי לסייע בפיתוח אבחון מוקדם וטיפולים פוטנציאליים.
שפע של כלים גנטיים ומולקולריים קיים Drosophila לנתח את המבנה והתפקוד של הצומת neuromuscular (NMJ, ראה9 לסקירה של NMJ זחל מאופיין היטב). כלים אלה בשילוב עם תוחלת חיים קצרה הופכים את Drosophila למודל מצוין לחקר שינויים ניווניות ב- NMJ. באופן ספציפי, MNs innervating שרירים למבוגרים נמצאים לאורך תוחלת החיים של ~ 90 יום למבוגרים והם כפופים לתהליכי הזדקנות נורמליים10,11,12,13. לכן, MNs הבוגרים מספקים הזדמנות לחקור שינויים ניווניים איטיים בניגוד ל- NMJs זחלים הקיימים רק פרק זמן קצר ~ 1 שבוע לפני מטמורפוזה14,15.
כאן, אנו מתארים הליך ניתוח המאפשר לנו לבצע ניתוח אימונוציטוכימי של MNs ברגל הבוגרת. כל רגל בוגרת היא innervated על ידי ~ 50 MNs, אשר לסנאפסה על שרירי הרגל הקשורים לנהוג בקטר. האנטומיה של הרגל, הפיזיולוגיה המכנית והנוירוביולוגיה תוארו היטב16,17,18. ארבורים אקסון של MNs רגל התאפיינו בעבר על ידי הדמיה באמצעות חתך באוכלוסיות תאים מלאות או מתויגות גנטית באמצעות מערכת Gal4 / UAS הדו-צדדית ושיטות הדמיה פורסמו בעבר19. שיטות הניתוח המוצגות כאן משמרות את המורפולוגיה המסתעפת של אקסון ומאפשרות לנו לנצל מגוון רחב של נוגדנים כדי לתייג רכיבים מולקולריים שונים של NMJ. עבודתנו הקודמת התמקדה בהקרנות של MN מוגדר ברגל המטה-מורקטית (השלישית), אשר ממקמת את שריר מנוף השוקה (tilm) ומציגה דפוסי ארבורציה עקביים ומספרי בוטון. בתחילה חקרנו שינויים תלויי גיל במוטנטים של Drosophila superoxide 1 (dsod1) ומצאנו שינויים העולים בקנה אחד עם פירוק NMJ20. שיטות ניתוח אלה מציעות את ההזדמנות לאפיין טוב יותר שינויים ניווניים איטיים ב- NMJ עבור מודלים אחרים של ALS, מחקרים בסיסיים של הזדקנות ומחלות אחרות הקשורות ל- MN.
איור 1. סיכום זרימת עבודה עבור כריתת רגליים. עיין בפרוטוקול לקבלת שלבים מפורטים. (א,ב) זבובים נבחרים ומונשמים. (ג) זבובים מועברים למתנול ונשטפים עם PBS. (D) הרגליים המטה-תותוריות מוסרות בבסיס הקוקסה תוך הדמיה עם מיקרוסקופ מנתח (~ הגדלה של פי 30); סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ה) הרגליים קבועות לאחר מכן בפתרון פורמלדהיד /PBS של 3.7% למשך 30 דקות בתוך בארות של צלחות של 24 בארות ולאחר מכן FA מוסר על ידי שטיפות עם PBS. (ו, ז, ה) הרגליים מועברות למגשי ניתוח אלסטומר סיליקון וחתיכת ציפורניים מוסרת מ עצם הירך הפרוקסימלית באמצעות מלקחיים משופעים תוך הדמיה תחת מיקרוסקופ ניתוח ב 80x; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (I) הרגליים הן לאחר הניתוח קבוע FA ונשטף PBS ולאחר מכן PBT (PBS + 0.1% פעילי שטח לא יוני). (J) הרגליים כפופות להכתמה חיסונית. (ק,ל) הרגליים מועברות למגלשת זכוכית, מנוקות במדיה הרכבה, ומכוסות בכיסוי המכיל מרווחי חרס; מוטות קנה מידה = 2 מ”מ ו 500 מיקרומטר. (M) הרגליים מדמות מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרגל הבוגרת Drosophila היא מודל אידיאלי לחקר ניוון עצבי בהתחשב בפשטות יחסית עם MNs מאופיין היטב ממופה שושלות neuroblast ודפוסי arborization סטריאוטיפי. מספר דיווחים השתמשו בעבר MNs רגל לחקר של מחלה ניווניות21,22. מחקרים אלה השתמשו בקווים המבטאים GFP בשילוב עם ניתוח פסיפס עם סמן תא דכאני (MARCM) כדי לדמות דרך החתך ותיעדו סדרה של שינויים מורפולוגיים. הדמיית NMJs למבוגרים על ידי אימונוציטוכימיה עם חותך חתך מאפשר אפיון נוסף עם היכולת לעקוב אחר שינויים מולקולריים מורכבים באמצעות ארגז כלים של נוגדנים זמינים.
החלק החיסוני של פרוטוקול זה הוא סטנדרטי יחסית והוא יכול להיות מיושם ללא תלות genotype (ראה23 לתיאור מצוין של שיטות מכתים נוגדנים כלליות לשימוש עם Drosophila). יתר על כן, ניתן לקבוע פרמטרים כגון עוצמת פלואורסצנטיות, אורך ענף אקסון ומספרי בוטון וגודל באמצעות מגוון פקודות מאקרו זמינות של ImageJ לאחר לכידה של תמונות ושיטות מפורטות לניתוח כמותי (לדוגמה, ראה24,25,26). לפיכך, טכניקת הניתוח היא החידוש העיקרי המתואר כאן. לפני הניתוח, זבובים שקועים באלכוהול כדי להפשיט פחמימנים. אתנול ומתנול משמשים בדרך כלל למטרה זו; עם זאת, השתמשנו רק במתנול. קריטי להצלחה לנתח הם מספר גורמים: ראשית, באמצעות מלקחיים מותאמים עם שיפוע מאפשר מגע שטחי מאוד עם הקיטור. שנית, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח המסוגל להגדיל את ההגדלה הכוללת של 60-100x כך שפני השטח של החתך נראים בבירור. עבור מיקרוסקופים עם הגדלה מקסימלית נמוכה יותר, יעדי 2x זמינים עבור רוב המותגים הנפוצים וצריכים להספיק בשילוב עם עדשות קיימות. שלישית, שלב הקיבעון הראשוני הופך את הקיטור לשברירי וקל יותר להתרחק מבלי לפגוע בשריר שמתחתיו. קיבוע יתר בשלב זה הופך את הרגל כולה נוקשה מדי עבור ניתוח יעיל. לכן, הקיבעון הראשוני צריך להיות מוגבל ל 30 דקות. הקיבעון פורמלדהיד לא יחדור מספיק כדי לחצות ביעילות את הרקמה הבסיסית בתקופה קצרה זו ולכן יש צורך בשלב קיבעון שני. לפני הקיבעון השני, יש לשמור רקמות על קרח כדי למנוע השפלה ושינויים במורפולוגיה. רביעית, מצאנו לנתח דגימות בעוד הקור הוא גם חשוב, סביר מסיבות דומות כי חותך הוא שביר חתיכה קטנה ניתן להסיר בקלות רבה יותר.
עם תרגול, אנו מוצאים ~ 50% של ניתוחים יהיה שמיש בתוך ללא נזק לרקמות ניכר. למרות אחוז זה עשוי להיראות נמוך יחסית כמה רקמות אחרות, הליך הניתוח הוא מהיר, ורגליים רבות ניתן לעבד בתוך 30- 60 דקות. לכן, גם אם שיעורי ההצלחה נמוכים בתחילה, זה אפשרי להשיג 4-5 דגימות טובות עבור כל קבוצת ניסוי. עם זאת, מגבלה עשויה להיות מספר הזבובים הזמינים בכל זמן נתון אם גנוטיפים ו/או גיל גורמים לקטלניות משמעותית.
מגבלה נוספת היא שלא הצלחנו לנתח אזורים אחרים ברגל מעבר לאזור הפרוקסימלי של עצם הירך בשל גודל. לכן, אנו יכולים ללמוד ארבורים MN מזוהים innervating TILM אמין וניתן לנתח חתך מעל שריר דיכאון השוקה עם שינויים קטנים לאופן שבו הרגל מכוונת בעת ניתוח. עם זאת, גישה לאזורים אחרים של הרגל הוכיחה קשה יותר מבלי לשבש את הארכיטקטורה האקסונית במהלך הניתוח.
כאן, אנו מציגים שיטות ניתוח כדי לזהות שינויים ב- NMJ הבוגר עבור MNs מוגדרים innervating tilm באמצעות אימונוציטוכימיה. הרגל שימושית כמערכת פשוטה, פנימי על ידי רק ~ 50 MNs ומכיל 14 שרירים עם אנטומיה מתוארת היטב. ניתן להשתמש בהכנת הרגל המנותח על פני גנוטיפים וחבילת נוגדנים זמינה להדמיה של NMJ ללא צורך בבניית מלאי מורכב גנוטיפי של מבנים גנטיים עיתונאיים ברקע מוטנטי. גישה זו תאפשר אפיון מפורט יותר של שינויים ב- NMJ למחלות MN ותנאים אחרים הקשורים לגיל.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאריק רוברטס על עצת ההדמיה. אנו גם רוצים להודות לשירותי טכנולוגיית המידע במכללת רוד איילנד ובמיוחד למייקל קיין וג’ייק דאגלס על צילום וידאו. נוגדנים חד שבטיים נגד dlg ואנטי-brp פותחו על ידי UC-Berkeley ואוניברסיטת וירזבורג בהתאמה, והושגו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים, שנוצר על ידי NICHD של NIH ומתוחזק באוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242, ארה”ב. המחקר שדווח כאן נתמך באופן מלא על ידי רשת המצוינות במחקר ביו-רפואי של רוד איילנד (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר המענק [P20GM103430].
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Génétique. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Development of the adult neuromuscular system. International Review of Neurobiology. 43, 221-239 (1999).
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
