結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム
1Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St. James’s Hospital, Trinity College Dublin,The University of Dublin, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences,Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 3SFI Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre,RCSI & TCD, 4SFI Centre for Research in Medical Devices (CURAM), RCSI,Dublin and National University of Ireland
Summary
結核菌の細胞内増殖を迅速かつ効率的に定量することは 、結核( TB)に対する改善された治療法を追求するために不可欠です。このプロトコルは、候補宿主指向療法で処理されたマクロファージのMtb増殖を定量するための自動液体培養システムを使用したブロスベースの比色検出アッセイについて説明しています。
Abstract
結核(TB)の原因物質である結核菌(Mtb)は、COVID-19の出現まで、世界で最も重要な感染症のキラーでした。Mtbは、細胞内環境で持続し、宿主防御を回避し、多くの抗結核薬に対する耐性を発達させるように進化してきました。耐性を解決するための1つのアプローチは、Mtbに対する宿主の免疫応答を高める既存の承認薬を特定することです。これらの薬剤は、治療時間を短縮し、抗生物質耐性を克服するのに役立つ補助的な宿主指向性療法(HDT)として再利用することができます。
マクロファージにおける細胞内Mtb増殖の定量化は、潜在的なHDTを評価する上で重要な側面です。Mtbの成長を測定するためのゴールドスタンダードは、寒天プレート上のコロニー形成単位(CFU)をカウントすることです。これは、薬物の迅速なスクリーニングには適さない、遅く、労働集約的なアッセイです。このプロトコルでは、臨床検体中のMtbを検出するためにより一般的に使用される自動化されたブロスベースの培養システムが、宿主向け療法の前臨床スクリーニングに適合しています。HDTで処理したマクロファージにおける細胞内Mtb増殖を調べるための液体培養アッセイシステムの能力を評価した。Mtbの成長を阻害する能力についてテストされたHDTは、溶液中およびポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)微粒子にカプセル化されたオールトランスレチノイン酸(AtRA)、およびインターフェロンガンマとリネゾリドの組み合わせでした。CFU法に対するこの自動液体培養ベースの技術の利点には、セットアップの単純さ、労働集約的な準備の軽減、および結果までの時間の短縮が含まれます(寒天プレートの21日以上と比較して5〜12日)。
Introduction
結核の原因物質である結核菌(Mtb)は、2019年に世界で最も重要な感染症キラーでした1。宿主防御を回避するために、Mtbはマクロファージや樹状細胞(DC)などの自然免疫細胞のマイコバクテリア活性を覆し、細胞内で持続して複製できるようにします2。成人の肺結核を予防するための効果的なワクチンの欠如と薬剤耐性株の出現の増加は、新しい治療法の緊急の必要性を浮き彫りにしています。
補助的な宿主指向療法(HDT)は、治療時間を短縮し、耐性を克服するのに役立つ可能性があります3。マクロファージ内のマイコバクテリア活性を決定するためのHDT候補のin vitroでの前臨床評価は、多くの場合、固体寒天プレート上のコロニー形成ユニット(CFU)によるMtb増殖の定量に依存しています。これは、薬物の迅速なスクリーニングには適さない、遅く、労働集約的なアッセイです。市販の自動ブロスベースの微生物検出システムは、臨床微生物学ラボで、臨床検体中のMtbおよびその他のマイコバクテリア種の検出および薬剤感受性試験に一般的に使用されています4。これらの機器は、培養培地の物理的変化(CO2またはO2レベルまたは圧力の変化)をもたらす細菌代謝活性に基づいて間接的に増殖を測定し、経時的に監視する5。測定値は陽性になるまでの時間(TPP)であり、これは治療に反応した結核患者の喀痰標本6,7および感染したマウス肺および脾臓の溶解物8のMtb CFUと相関することが以前に示されています。さらに、液体培養検出システムは、アクセニック培養および培養マクロファージにおけるマイコバクテリアの増殖に対する従来の病原体指向療法の効果を測定するために使用されてきた9,10。この装置は、樹状細胞および肺胞マクロファージがMtb11,12の細胞内増殖を制御する生来の能力を調べるためにも使用されています。この実験プロトコルは、液体培養診断システムが、培養マクロファージにおける結核に対するHDTの前臨床スクリーニングを実行するように適合できることを示しています。CFU列挙と比較して、この技術の主な利点は、細胞内マイコバクテリアの増殖/生存を定量化するために必要な実験労力と時間を大幅に削減できることです。この技術は、宿主の免疫を高めるために細胞機能を標的とする幅広い薬理学的試薬で処理された免疫細胞における細胞内マイコバクテリアの生存を評価するために使用できる自動培養装置へのアクセスに依存しています。
Protocol
このプロトコルで概説されている実験は、封じ込めレベル2の実験室で処理できるMtbの弱毒化H37Ra株を使用して実施されました。生きたマイコバクテリアのすべての操作は、クラスII生物学的安全キャビネット(BSC)で行われました。実験手順は、エアロゾルの発生を最小限に抑えるように設計されました。真核細胞培養(THP-1細胞)もクラスII BSCで行った。研究所はリスク評価を実施し、すべての?…
Representative Results
この研究で使用された自動液体培養装置は、10分ごとにCO2 レベルを監視します。計器ボトルの下部にあるセンサーの色の変化は比色で測定され、反射率単位で表されます。次に、機器ソフトウェアは検出アルゴリズムを適用して、陽性になるまでの時間(TTP)、つまり接種から培養物が陽性としてフラグが立てられるまでの日数を計算します(図1A)。初期接種材料?…
Discussion
著者らは、このプロトコルに記載されている液体培養法を使用して、単球由来のマクロファージと肺胞マクロファージ、およびPMA11、16、17で分化したTHP-1細胞のMtb増殖を監視しました。この技術は、非接着性細胞12と共に使用するために改変することもできる。最近では、この装置は、TB17</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、アイルランド科学財団(SFI 08 / RFP / BMT1689)、アイルランドの健康研究委員会[HRA-POR/2012/4およびHRA-POR-2015-1145]およびダブリン王立病院トラストによって資金提供されました。
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), 148-151 (2014).
- O’Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O’Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O’Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O’Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O’Connor, G., et al. Sharpening nature’s tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O’Sullivan, M. P., O’Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), 453-488 (2012).
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Citer Cet Article
O’Leary, S., Bahlool, A. Z., O’Connor, G., Cryan, S., Keane, J. M., O’Sullivan, M. P. An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis. J. Vis. Exp. (174), e62838, doi:10.3791/62838 (2021).