نظام زراعة آلي للاستخدام في الاختبارات قبل السريرية للعلاجات الموجهة للمضيف لمرض السل
Summary
يعد القياس الكمي السريع والفعال لنمو المتفطرة السلية داخل الخلايا أمرا بالغ الأهمية لمتابعة العلاجات المحسنة ضد السل (TB). يصف هذا البروتوكول مقايسة الكشف اللوني القائمة على المرق باستخدام نظام زراعة سائل آلي لتحديد نمو MTB في الضامة المعالجة بالعلاجات الموجهة للمضيف المرشح.
Abstract
كانت المتفطرة السلية (Mtb) ، العامل المسبب لمرض السل (TB) ، أهم قاتل للأمراض المعدية على مستوى العالم حتى ظهور COVID-19. تطور MTB ليستمر في بيئته داخل الخلايا ، ويتهرب من دفاعات المضيف ، وقد طور مقاومة للعديد من الأدوية المضادة للسل. تتمثل إحدى طرق حل المقاومة في تحديد الأدوية المعتمدة الحالية التي ستعزز الاستجابة المناعية للمضيف ل MTB. يمكن بعد ذلك إعادة استخدام هذه الأدوية كعلاجات مساعدة موجهة للمضيف (HDT) لتقصير وقت العلاج والمساعدة في التغلب على مقاومة المضادات الحيوية.
يعد القياس الكمي لنمو MTB داخل الخلايا في الضامة جانبا حاسما في تقييم HDT المحتمل. المعيار الذهبي لقياس نمو MTB هو حساب وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) على ألواح أجار. هذا اختبار بطيء كثيف العمالة لا يصلح للفحص السريع للأدوية. في هذا البروتوكول ، تم تكييف نظام استزراع آلي قائم على المرق ، والذي يستخدم بشكل أكثر شيوعا للكشف عن Mtb في العينات السريرية ، للفحص قبل السريري للعلاجات الموجهة للمضيف. تم تقييم قدرة نظام مقايسة الاستزراع السائل على التحقيق في نمو MTB داخل الخلايا في البلاعم المعالجة ب HDT. كانت HDTs التي تم اختبارها لقدرتها على تثبيط نمو Mtb عبارة عن حمض الريتينويك المتحول بالكامل (AtRA) ، سواء في المحلول أو المغلف في الجسيمات الدقيقة المتعددة (حمض اللاكتيك – كو – الجليكوليك) (PLGA) ومزيج من إنترفيرون جاما ولينيزوليد. تشمل مزايا هذه التقنية الآلية القائمة على الاستزراع السائل على طريقة CFU بساطة الإعداد ، وإعداد أقل كثافة في العمل ، ووقت أسرع للنتائج (5-12 يوما مقارنة ب 21 يوما أو أكثر لألواح الآجار).
Introduction
كانت المتفطرة السلية (Mtb) ، العامل المسبب للسل ، أهم قاتل للأمراض المعدية على مستوى العالم في عام 20191. للتهرب من دفاعات المضيف ، يخرب Mtb نشاط المتفطرات للخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والخلايا المتغصنة (DCs) ، مما يسمح لها بالاستمرار داخل الخلايا وتكرار2. إن عدم وجود لقاح فعال للوقاية من السل الرئوي لدى البالغين والظهور المتزايد للسلالات المقاومة للأدوية يسلط الضوء على الحاجة الملحة إلى علاجات جديدة.
يمكن للعلاجات المساعدة الموجهة للمضيف (HDT) تقصير وقت العلاج والمساعدة في التغلب على المقاومة3. غالبا ما يعتمد التقييم قبل السريري لمرشحي HDT في المختبر لتحديد نشاط مبيدات الفطريات داخل البلاعم على القياس الكمي لنمو Mtb بواسطة وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) على ألواح أجار صلبة. هذا اختبار بطيء كثيف العمالة لا يصلح للفحص السريع للأدوية. تستخدم أنظمة الكشف عن الميكروبات الآلية القائمة على المرق المتاحة تجاريا بشكل أكثر شيوعا في مختبرات علم الأحياء الدقيقة السريرية للكشف واختبار حساسية الأدوية ل Mtb وأنواع المتفطرات الأخرى في العينات السريرية4. تقيس هذه الأدوات النمو بشكل غير مباشر بناء على النشاط الأيضي البكتيري الذي يؤدي إلى تغيرات فيزيائية في وسائط الاستزراع (التغير في مستويات أو ضغط ثاني أكسيد الكربون 2 أو O2) الذي يتم رصده بمرور الوقت5. القراءة هي حان الوقت للإيجابية (TPP) ، والتي ثبت سابقا أنها ترتبط ب Mtb CFU في عينات البلغم لمرضى السل استجابة للعلاج 6,7 وفي محللات رئة الفئران المصابة والطحال8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أنظمة الكشف عن الاستزراع السائل لقياس تأثير العلاجات التقليدية الموجهة لمسببات الأمراض على نمو المتفطرات في الثقافة المحورية والبلاعم المستزرعة9،10. كما تم استخدام الأداة للتحقيق في القدرة الفطرية للخلايا المتغصنة والبلاعم السنخية للتحكم في النمو داخل الخلايا ل Mtb11,12. يوضح هذا البروتوكول التجريبي أنه يمكن تكييف نظام تشخيص المزرعة السائلة لإجراء الفحص قبل السريري ل HDT لمرض السل في الضامة المستزرعة. بالمقارنة مع تعداد CFU ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل بشكل كبير من العمل التجريبي والوقت اللازم لتحديد نمو / بقاء المتفطرات داخل الخلايا. تعتمد هذه التقنية على الوصول إلى أداة زراعة آلية يمكن استخدامها لتقييم بقاء المتفطرات داخل الخلايا في الخلايا المناعية المعالجة بمجموعة واسعة من الكواشف الدوائية التي تستهدف الوظائف الخلوية لتعزيز مناعة المضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدم المؤلفون طريقة الاستزراع السائل الموصوفة في هذا البروتوكول لمراقبة نمو MTB في الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة والبلاعم السنخية وخلايا THP-1 المتمايزة مع PMA11،16،17. يمكن أيضا تعديل هذه التقنية للاستخدام مع الخلايا غير الملتصقة<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم في أيرلندا (SFI 08 / RFP / BMT1689) ، ومجلس البحوث الصحية في أيرلندا [HRA-POR / 2012/4 و HRA-POR-2015-1145] وصندوق مستشفى مدينة دبلن الملكية.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), 148-151 (2014).
- O’Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O’Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O’Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O’Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O’Connor, G., et al. Sharpening nature’s tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O’Sullivan, M. P., O’Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), 453-488 (2012).
