ゼブラフィッシュ胚からのナイーブ・ブラストデム・エクスプラントの生成

1 試薬と消耗品の準備 試薬製剤 3x Danieauの溶液を500mL用意する(ソリューション1、表1)。 卵水1Lを準備する(溶液2、表1)。 卵水にアガロースの1.2%溶液を調製します。電子レンジでアガロースを完全に溶かし、水浴で55°Cに冷却します。 4 mL外植培地を用意(溶液3、表1、19,21)からわずかに変更した実験条件で調製する。注:必要な体積を計算する際には、注入されていない(または注入されたコントロール)胚からの外植の少なくとも1つの井戸を考慮してください。 70%エタノールでワークスペースを消毒します。 4°Cから細胞培養培地を取り除き、70%エタノールでスプレー/ワイプします。 胚を注入しながら、外植培地を作り、28.5°Cインキュベーターに温める。注:ステージング目的のために、年齢に一致した無傷の兄弟胚を常に含めます。これらの胚をデコール化し、0.3xダノー溶液中のアガロースコーティングされたプレート上で培養する(溶液4、表1)。 プロナーゼアリコート(20mg/mLで1 mL)を-20°Cから取り除き、氷の上で解凍します。3つの実験条件ごとに1つの1 mLアリコートを解凍する。 アガロースプレートを準備する 射出プレートを作ります。 卵水に溶融アガロースを半方で100ミリメートル×15ミリメートルプラスチックペトリ皿を埋めます。 溶けたアガロースの上に緩やかに射出金型を45°の角度で置き、徐々にアガロースに下げ、泡が下に閉じ込められないようにします。完全に冷やしましょう。 金型を取り外します。すぐに使用するか、卵水2mLを加えて、プレートを包み、4°Cで保存して保存してください。 28.5°Cインキュベーターで15~30分間プレートを温めてから、注入します。 外植の切断プレートを作ります。 60mm x 15mmのペトリ皿に溶けた1.2%アガロースを3mL加え、井戸の底全体がコーティングされていることを確認します。完全に冷やしましょう。 アガロースで培養プレートをコーティングします。 各実験条件について、卵水中の1mLの1mLを卵水中の1つのウェルウェルに分配し、ウェルの底全体がコーティングされていることを確認します。完全に冷やしましょう。 キメラの外植を作るために、60 mm x 15 mm ペトリ皿で溶けたアガロースに 1 2 mm ガラスビーズを加えて、小さい井戸を使った外植加工皿を作ります。アガロースが完全に冷めたら、鉗子でビーズを取り除きます。 2 RNAで胚を注入する 手袋を着用し、-80°Cで貯蔵から合成 ndr2 mRNAのアリコートを取り除き、すぐに氷の上に置きます。 注射針を準備します。 引っ張られたガラスの毛細血管の針にRNAを入れます。充填した針をマイクロマニピュレータに入れ、針の先端を鉗子で割ります。 ミネラルオイルの滴でステージマイクロメーターを使用して注入量を校正し、空気圧インジェクターの注入時間と圧力を調整して、所望の大きさのボーラスを達成します。直径120μmのボーラスは1nLの体積を有する。注:ボーラスの所望の体積は、RNAの濃度と胚あたりの所望の用量に依存します。例えば、RNAが10 ng/μLでアリクォートされている場合、1 nLを注入して10pgの最終量を達成します。 RNA針の先端を注入する準備ができるまで油に沈めておきます。 胚をロードし、注入します。 飼育タンクで仕切りを引き、魚が10〜15分間産卵し、ティーストレーナーを使用して胚を収集します。 パスツールピペットとピペットポンプを使用して胚を注入プレートにロードし、手袋をした指を使って卵をトラフにそっと押し込みます。 所望の数の胚に達するか、胚が分裂し始めるまで、単細胞胚の黄身に10pg ndr2 RNAを注入する。注:単細胞段階の後に注入して、胚全体のRNAの均一な分布を確保しないでください。 注射プレートから胚を、絞り瓶から卵水の穏やかな流れでラベル付きの100 mm x 15 mmペトリ皿に洗い出します。注: 常に、年齢に一致する、注入されていない兄弟のグループをコントロールとして保持します。 128細胞の段階に到達するまで、胚を28.5°Cインキュベーターに入れる。未受精卵と死んだ胚を皿から取り除きます。 3 胚をデコールネイトする 胚が128細胞の段階に達したら、ラベル付きガラスペトリ皿に入れ、そこからできるだけ多くの卵水をデカントします。 ラボテープ(小さな皿の名前に対応)でガラス結晶皿にラベルを付け、卵の水で道の2/3を埋めます。迅速なアクセシビリティのために解剖顕微鏡の隣にこれらの料理を置きます。 50 mL 円錐管に3x ダノー溶液の 15 mL にプロナーゼストック (20 mg/mL, 氷の上で解凍) を 1 mL 加えます。注: この量は、最大 3 つの実験条件で十分です。追加の外植条件のためのプロナーゼと3xダニアウのソリューションの量を増やします。注意:プロナーゼは刺激性です。したがって、取り扱い時に手袋を着用してください。 胚を含む各ガラスペトリ皿にプロナーゼ溶液の少なくとも5 mLを追加します。 ガラス皿を円形の動きで攪拌し、解剖顕微鏡の下で一貫してデコール化の進行を監視する。 コリオンがしわになり始め、1〜2個の胚がコリオンから出たら、プロナーゼと胚を含むガラスペトリ皿を卵水を含む対応するガラス結晶皿に慎重にダンクします。 デコリオネート胚を洗う。 卵水で胚を3回洗い、卵水を軽く加えてから皿からデカンをします。 3回目と最後の洗浄は、0.3xダニアウのソリューションです。注:胚が洗浄後もまだ経合部を持っている場合は、骨が取り除かれるまで胚を穏やかにピペット化するか、洗浄物(卵水または0.3xダニアウの溶液)に1〜2分間座らせ、円形の動きで穏やかに攪拌します。 ペトリ皿の蓋でデコリオネート胚を覆い、256細胞の段階に達するまでインキュベーター(28.5°C)に戻します。 4 切り出し アガロースコーティングされた60mm x 15mmのペトリ皿に3xダニアウの溶液を充填します。 胚が256細胞の段階になったら、3xダニアウの溶液を含むアガロースコーティングされたプレートに移し、皿の中央に沿って並べます。 鉗子を使って外植を切る(図1)。 一対の鉗子を使用して、閉じた状態で、胚を安定化させ、もう一方を使用して(マージンから動物の極まで)、その高さの約半分でブラストドラムを切断する(図1A)。 切断するには、1組の鉗子でブラストデrm細胞を軽く絞ります。次に、安定化鉗子を取り、他の鉗子に沿ってそれらを実行して、blastodermを横切ってほぼ半分にスライスします(図1B)。 胚を回転させ、鉗子を既存の切り取りに入れ、残りのブラソドナルを最初の切り抜きに切断する(図1C)。 3xダニアウの溶液に外植物を少なくとも5分間保ち、アガロースでコーティングされ、4 mLの外植培地で満たされた6ウェルプレートの井戸に移します。注: 負のコントロールとして、注入されていない (またはコントロールが挿入された) 兄弟から外植を切り取ります。外植が正しく行われれば、これらの外植は内胚葉、中胚葉、または神経外胚葉のマーカーを拡張も発現もしない。 必要なタイムポイント/ステージ(無傷の兄弟から決定される)に達するまで、外植培養プレートを28.5°Cインキュベーターに入れます。注:低分子阻害剤などの化合物で外植物を処理する場合、所望の濃度は、所望の時点でウェル内の外植培地に直接添加することができます。濃度を計算する際には、アガロースの体積を含める必要があります。(例:1 mLアガロース+4 mL外植培地=井戸当たり総容積5mL)。 5 キメラエクスプランツの準備 通常のアガロースコーティングプレートの代わりに、アガロースを11mmガラスビーズを使用して12の小さな浅い井戸に成形した皿の中でキメラの外植木をカットします(セクション1.2.4)。このプレートに3xダニアウの溶液を入れなさい。注:キメラ外植は、異なる遺伝子型または条件の2つの胚の芽細胞から生成されます。トランスジェニックまたは注入された蛍光マーカーの発現により、これらの条件を互いに区別できることを確認してください。 1つの遺伝子型/条件の12個の胚をプレートの左側に、もう1つの遺伝子型/条件の12個の胚をプレートの右側に追加して準備します。 各条件の1つの胚をプレートの中央に、12の井戸の1つの近くに移動します。 鉗子を使用して、単一胚の外植体について説明したように、各胚から外植を切断する(ステップ4.3)。 2つの外植のカットエッジを、鉗子を使用して浅い井戸内で一緒に押し、2つの半分を単一の外植に一緒に癒すことができます。 プレート内の残りの11個の井戸を続けます。外植が癒されたら、アガロースでコーティングされ、4 mLの外植培地で満たされた6ウェルプレートの井戸に移します。必要な数の外植が達成されるまで繰り返します。 6 固定外植の文化や画像 28.5°Cインキュベーター中の培養は、そのままの兄弟胚が所望の段階に達するまでである。 ライブ外植は、連続的なタイムラプスイメージングのために取り付けたり、培養期間を通して定期的にイメージングしたり、実験エンドポイントでライブ画像化することができます。 必要に応じて、外植を修正します。外植が所望のエンドポイントに到達したら、無傷の胚兄弟の段階に注意し、PBSで4%パラホルムアルデヒドの1 mLを有するガラスシンチレーションバイアルに外植を置く。4°Cのシェーカーで一晩固定します。注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。この化学物質を取り扱う際には手袋を着用し、各機関が承認した方法で処分してください。 固定後、6回、15分ずつPBS+0.1%Tween-20で外植をすすいで、徐々にメタノールに脱水する。外植体を-20°Cで保存し、後で全マウント をその場でのハイブリダイ ゼーション、免疫蛍光染色などで分析します。