제브라피시 배아에서 나이브 Blastoderm 의 세대

1 시약 및 소모품 준비 시약 준비 3배 다니오의 솔루션 500mL준비(솔루션 1, 표 1). 달걀 물 1 L을 준비합니다 (용액 2, 표 1). 달걀 물에 아가로즈 1.2% 용액을 준비합니다. 아가로즈를 전자레인지에 완전히 녹인 다음 수조에서 55°C로 식힙니다. 실험 조건당 4mL 엑셀미디어(솔루션 3, 표 1,19,21에서약간 수정)를 준비한다.참고: 필요한 부피를 계산할 때 주입되지 않은 배아(또는 주입된 대조군)에서 적어도 하나의 우물을 고려해야 합니다. 70%의 에탄올로 작업 공간을 소독합니다. 세포 배양 매체를 4°C에서 제거하고 70% 에탄올로 분무/닦아냅니다. 배아가 주입되는 동안 따뜻하게 28.5 °C 인큐베이터에 엑스플랜트 매체와 장소를 만듭니다.참고: 준비 목적으로 연령 일치, 그대로 형제 배아를 항상 포함합니다. 이러한 배아를 dechorionate 하 고 0.3 x Danieau의 용액에 아가로즈 코팅 플레이트에 그들을 문화 (솔루션 4, 표 1). pronase 알리코 (20 mg/mL에서 1 mL)를 -20 °C에서 제거하고 얼음에 해동 할 수 있습니다. 3개의 실험 조건에 대해 1mL 알리쿼트 1개를 해동합니다. 아가로즈 플레이트 준비 사출 플레이트를 만드십시오. 달걀 물에 녹은 아가로즈와 함께 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시 반웨이를 채웁니다. 용융 아가로즈 위에 45° 각도로 사출 몰드를 부드럽게 놓고 점차적으로 아가로즈로 낮추어 거품이 아래에 갇히지 않도록 합니다. 완전히 식힙니다. 금형을 제거합니다. 접시를 즉시 사용하거나 계란 물 2mL를 추가하고 접시를 감싸고 4 °C로 보관하여 나중에 저장하십시오. 주사 전에 28.5 °C 인큐베이터에서 15-30 분 동안 플레이트를 데우습니다. 절삭 판을 식재하십시오. 달걀 물에 녹은 1.2% 아가로즈 3mL을 60mm x 15mm 페트리 접시에 추가하여 우물의 전체 바닥을 코팅합니다. 완전히 식힙니다. 아가로즈가 있는 코트 컬쳐 플레이트. 각 실험 조건에 대해 달걀 물에 1mL의 용융 1.2 %의 아가로즈를 6 웰 플레이트의 한 우물에 분배하여 우물의 전체 바닥이 코팅되도록합니다. 완전히 식힙니다. 키메라 이출을 위해 60mm x 15mm 페트리 접시에 아가로즈를 녹여 12 mm 유리 구슬을 추가하여 작은 우물이 있는 절삭 접시를 만듭니다. 아가로즈가 완전히 식으면 집게로 구슬을 제거합니다. 2 RNA로 배아 주입 장갑을 착용하고 -80 °C의 저장에서 합성 ndr2 mRNA의 알리쿼트를 제거하고 즉시 얼음에 놓습니다. 주사 바늘을 준비합니다. 끌어당겨진 유리 모세관 바늘을 RNA로 채웁니다. 채워진 바늘을 마이크로 조작기에 넣고 바늘 끝을 집게로 부수습니다. 미네랄 오일 한 방울을 가진 단계 마이크로미터를 사용하여 사출 부피를 보정하고, 공압 인젝터에 대한 주입 시간과 압력을 조정하여 원하는 크기의 볼러스를 달성합니다. 직경 120 μm의 볼루스는 1nL의 부피를 갖는다.참고: 볼루스의 원하는 부피는 RNA의 농도와 배아당 원하는 용량에 따라 달라집니다. 예를 들어, RNA가 10 ng/μL에서 알리인용되는 경우 1nL을 주입하여 최종 금액10 pg를 달성하십시오. RNA 바늘 팁은 주입할 준비가 될 때까지 오일에 잠긴 상태로 유지합니다. 배아를 적재하고 주입하십시오. 사육 탱크에서 칸막이를 당기고, 물고기가 10-15 분 동안 생성되도록하고, 차 여과기를 사용하여 배아를 수집합니다. 파스퇴르 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 배아를 사출 판에 넣은 다음 장갑을 낀 손가락을 사용하여 계란을 통틀로 부드럽게 누릅니다. 원하는 수의 배아가 도달할 때까지 또는 배아가 분열되기 시작할 때까지 10 pg ndr2 RNA를 단일 세포 배아의 노른자에 주입하십시오.참고: 배아 전체에 RNA의 분포를 보장하기 위해 단세포 단계 후에 주입하지 마십시오. 배아를 사출 판에서 100mm x 15mm 페트리 접시에 넣고 짜내기 병에서 달걀물을 부드럽게 흘려 넣습니다.참고: 항상 연령일치의 주입되지 않은 형제 그룹을 컨트롤로 유지합니다. 배아를 128세포 단계에 도달할 때까지 28.5°C 인큐베이터에 넣습니다. 요리에서 수정되지 않은 계란과 죽은 배아를 제거합니다. 3 배아를 데초리오네이트 배아가 128 세포 단계에 도달하면 라벨이 붙은 유리 페트리 접시에 넣고 가능한 한 많은 달걀 물을 데수합니다. 실험실 테이프 (작은 접시 이름에 해당)로 요리를 결정 유리 라벨과 계란 물로 방법의 2/3을 채우기. 이러한 요리는 해부 현미경 옆에 배치하여 빠른 접근성을 위해 합니다. 50mL 원물 튜브에 3배 다니오용 15mL에 pronase 스톡 1mL(20 mg/mL, 얼음 에 해동)을 추가합니다.참고: 이 양은 최대 3개의 실험 조건에 충분합니다. 추가 적인 절제 조건에 대 한 pronase 및 3 배 Danieau의 솔루션의 볼륨을 증가.주의: 프라나제는 자극제입니다. 따라서 취급 할 때 장갑을 착용하십시오. 배아를 함유한 각 유리 페트리 접시에 pronase 용액을 최소 5mL 이상 추가합니다. 유리 접시를 원형 운동으로 양시하여 해부 현미경으로 지속적으로 점초의 진행 상황을 모니터링합니다. 코리온이 주름이 생기기 시작하고 1-2 배아가 그들의 chorions에서 나오면, pronase와 배아를 포함하는 유리 페트리 접시를 계란 물을 포함하는 해당 유리 결정화 접시에 조심스럽게 덩크합니다. 비반향배아를 씻으시다. 접시에서 달걀 물을 부드럽게 첨가한 다음 탈유하여 배아를 달걀 물로 세 번 씻으십시오. 세 번째이자 마지막 세척은 0.3배 의 다니오용액입니다.참고: 배아가 세척 후에도 여전히 치리온이 있는 경우, 축고가 제거될 때까지 배아를 부드럽게 피펫하거나 1~2분 동안 세척(달걀 물 또는 0.3배 다니오의 용액)에 앉게 하고 원형 운동으로 부드럽게 동요하게 합니다. 페트리 접시 뚜껑을 사용하여 비반향된 배아를 덮고 256세포 단계에 도달할 때까지 인큐베이터(28.5°C)로 돌려보라고 한다. 4 컷 익스 아가로즈 코팅 60mm x 15mm 페트리 접시에 3배 다니오의 액액을 채우게 해줍니다. 배아가 256세포 단계에 있으면 3배 다니오의 용액이 들어 있는 아가로즈 코팅 판으로 옮기고 접시의 중심을 따라 일렬로 세워줍니다. 집게(도1)를사용하여 이식을 잘라냅니다. 닫힌 채 유지된 집게 한 쌍을 사용하여 배아를 안정화하고 다른 한 쌍을 사용하여 높이의 약 절반(여백에서 동물 극까지)에서 blastoderm을 절단합니다(그림1A). 잘라내기 위해, 부드럽게 집게 한 쌍으로 blastoderm 세포를 짜내. 그런 다음 안정화 집게를 가져 가서 다른 집게를 따라 실행하여 blastoderm(도 1B)을가로 질러 약 절반을 슬라이스합니다. 배아를 회전시키고, 기존의 절단에 집게를 배치한 다음, 나머지 blastoderm 직교를 첫 번째절단(도 1C)으로절단한다. 3x Danieau의 솔루션에 3배 이상 이식하여 치유한 다음 아가로즈로 코팅되어 4mL의 엑스미디어로 채워진 6웰 플레이트의 웰로 옮겨 보세요.참고: 주입되지 않은(또는 주입된 제어) 형제에서 제외 컨트롤로 절단합니다. 이 절제가 올바르게 수행되는 경우, 이러한 이 절제는 엔도름, 중소포 또는 신경 절제술의 마커를 연장하거나 표현하지 않습니다. 원하는 타임포인트/스테이지(그대로 형제에게서 결정된)에 도달할 때까지 배양 판을 28.5°C 인큐베이터에 넣습니다.참고: 소분자 억제제와 같은 화합물과 함께 이식하는 경우 원하는 농도를 원하는 시점 내에 있는 우물 내의 절제 된 미디어에 직접 첨가할 수 있다. 농도를 계산할 때 아가로즈의 부피를 포함해야 합니다. (예: 1 mL 아가로즈 + 4 mL 엑셀미디어 = 웰당 5mL 총 부피). 5 키메라 이출 준비 일반 아가로즈 코팅 플레이트 대신, 1mm 유리 구슬 (섹션 1.2.4)을 사용하여 12 개의 작고 얕은 우물로 성형 된 아가로즈가있는 접시에 키메라 이출을 자른다. 이 접시에 3배 다니오의 용액을 채우게 하십시오.참고: 키메라 박종은 다른 유전자형 또는 조건의 2개의 배아의 blastoderm 세포에서 생성됩니다. 이러한 조건이 형질전환 또는 주입형광마커의 발현에 의해 서로 구별될 수 있는지 확인하십시오. 플레이트의 왼쪽에 1개의 유전자형/상태의 12개의 배아와 플레이트의 오른쪽에 다른 유전자형/상태의 12개의 배아를 추가하여 준비한다. 12개의 우물 중 하나 근처에서 각 상태의 배아를 플레이트 의 중심으로 이동합니다. 집게를 사용하여 단일 배아 각경 (단계 4.3)에 대해 설명 된 바와 같이 각 배아에서 각 배아에서 각출자를 자른다. 두 개의 절단 된 가장자리를 빠르게 눌러 두 반쪽이 하나의 절개로 함께 치유 할 수 있도록 집게를 사용하여 얕은 우물 내에서 함께 흥분. 플레이트 안에 나머지 열한 우물을 계속. 이출이 치유되면 아가로즈로 코팅되어 4mL의 절제 된 미디어로 채워진 6 웰 플레이트의 우물로 옮겨 보입니다. 원하는 수의 이절이 이루어질 때까지 반복합니다. 6 고정 된 이식 문화 및 / 또는 이미지 배양은 그대로 형제 배아가 원하는 단계에 도달할 때까지 28.5°C 인큐베이터에서 이배합니다. 라이브 이식은 연속적인 타임랩스 이미징을 위해 장착할 수 있으며, 배양 기간 동안 주기적으로 이미지화되거나 실험적인 엔드포인트에서 실시간으로 이미지화될 수 있다. 원하는 경우 이식을 수정합니다. 일단 소멸이 원하는 끝점에 도달하면, 그대로 태아 형제의 단계를 기록하고 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 1 mL와 유리 신경병 유리 바이알에 이출을 배치합니다. 4 °C에서 셰이커에 하룻밤 을 수정합니다.주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 이 화학 물질을 취급할 때 장갑을 착용하고 각 기관에서 승인한 방법을 통해 폐기하십시오. 고정 후, 헹구는 것은 PBS + 0.1% Tween-20으로 각각 6번, 15분씩 이발하고, 메탄올로 점차적으로 탈수합니다. 시투 혼성화, 면역형광 염색 등에서 전체 마운트에 의해 나중에 분석을 위해 -20°C에 저장하십시오.