فحص الخصائص الهيكلية والديناميكية للهياكل النانوية دون الخلوية عن طريق التحليل الطيفي للتذبذب الزماني المكاني
Summary
يتم تطبيق تحليل متوسط الإزاحة المربعة (iMSD) المشتق من التصوير على الماكروبينوسومات لتسليط الضوء على طبيعتها الجوهرية المتطورة زمنيا من حيث الخصائص الهيكلية والديناميكية. ثم تتم مقارنة Macropinosomes مع حبيبات إفراز الأنسولين (ISGs) كمرجع للهياكل دون الخلوية مع متوسط الخصائص الهيكلية / الديناميكية الثابتة زمنيا.
Abstract
يستخدم متوسط الإزاحة المربعة المشتق من التصوير (iMSD) لمعالجة الخصائص الهيكلية والديناميكية للهياكل النانوية دون الخلوية ، مثل الحويصلات المشاركة في الاتجار الداخلي / الإفرازي للمذابات والجزيئات الحيوية. يعتمد iMSD على التصوير القياسي بالفاصل الزمني ، وهو متوافق مع أي إعداد بصري ، ولا يحتاج إلى التركيز على كائنات فردية لاستخراج المسارات. من كل أثر iMSD ، يتم حساب ودمج ثلاثة أضعاف فريدة من متوسط المعلمات الهيكلية والديناميكية (أي الحجم والانتشار المحلي والمعامل الشاذ) لبناء “توقيع iMSD” للبنية النانوية قيد الدراسة.
تم إثبات فعالية هذا النهج هنا مع الحالة المثالية للماكروبينوسومات. تتطور هذه الحويصلات بمرور الوقت ، مما يغير متوسط حجمها وعددها وخصائصها الديناميكية التي تمر من المراحل المبكرة إلى المتأخرة من الاتجار داخل الخلايا. كعنصر تحكم ، يتم استخدام حبيبات إفراز الأنسولين (ISGs) كمرجع للهياكل دون الخلوية التي تعيش في حالة ثابتة يكون فيها متوسط الخصائص الهيكلية والديناميكية لجميع سكان الكائنات ثابتا في الوقت المناسب. يسلط تحليل iMSD الضوء على هذه الميزات الغريبة كميا ويمهد الطريق لتطبيقات مماثلة على المستوى دون الخلوي ، سواء في الحالات الفسيولوجية أو المرضية.
Introduction
تلعب الهياكل النانوية دون الخلوية (مثل الحويصلات الداخلية / الإفرازية والعضيات) دورا محوريا في تنظيم إشارات الخلايا1. يحدد الضبط السليم لخصائصها الهيكلية (مثل الحجم) و / أو الديناميكية (مثل الانتشار) كيفية استجابة الخلية للمحفزات الداخلية أو الخارجية2،3،4. بناء على هذه الأدلة ، ليس من المستغرب أن يتم العثور على تغييرات في هذه الخصائص في العديد من الحالات المرضية. وتشمل الأمثلة دور كثرة الخلايا الداخلية غير المنظمة في السرطان 2,3 ، والتغيرات الهيكلية والديناميكية الموجودة على مستوى ISGs في الخلايا β المعرضة لحالات مرض السكري من النوع2 5 ، وسوء تنظيم الخصائص الهيكلية والنقل الليزوزومية في حثل المادة البيضاء للخلايا الكروية أو داء الدهون galactosylceramide6 ، والاختلالات الوظيفية في المسار الداخلي الليزوزومي في الاضطرابات العصبية التنكسية (على سبيل المثال ، مرض الزهايمر)7.
في هذا السياق ، أثبت الباحثون مؤخرا أنه يمكن تحسين أداء طرق الفحص المجهري البصري القياسية من خلال ضبط دقة أخذ العينات المكانية والزمانية8 بشكل صحيح. وهذا بدوره قد يوفر مزيدا من التبصر في العمليات البيولوجية ذات الصلة. في الممارسة العملية ، أصبح ذلك ممكنا من خلال خوارزمية تحليل التقلبات الزمانية المكانية ، والتي تستخرج في وقت واحد متوسط الخصائص الهيكلية والديناميكية للأجسام المنتشرة مباشرة من المكدس القياسي لصور المجهر الضوئي دون أي حاجة إلى معرفة أولية حول الكائن البيولوجي ذي الأهمية واستخراج مسارات الجسم الواحد. يتم تضمين كل هذه المعلومات في إخراج واحد من الطريقة: تتبع iMSD9 (يتم إعطاء تفاصيل حول اشتقاق وتحليل تتبع iMSD في الملف التكميلي 1).
يتكون البروتوكول التجريبي الناتج من بضع خطوات. أولا ، يتم إجراء تصوير المنطقة ذات الاهتمام بدقة زمنية عالية. بعد ذلك ، يتم حساب متوسط وظائف الارتباط المكاني والزماني من كومة الصور. وأخيرا، من خلال التركيب الغاوسي لسلسلة دوال الارتباط، يتم الحصول على متوسط “قانون الانتشار” مباشرة من التصوير وتحليله للتعرف على وضع انتشار الكائن. وقد ثبتت بالفعل إمكانات هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من الأجسام البيولوجية، بدءا من الجزيئات إلى الجسيمات النانوية وحتى العضيات/الهياكل تحت الخلوية بأكملها9،10،11،12،13،14،15.
تقدم هذه الورقة تقارير عن تطبيق iMSD على الماكروبينوسومات لتسليط الضوء على طبيعتها الجوهرية التي لا رجعة فيها والتي تتطور زمنيا من حيث متوسط خصائصها الهيكلية والديناميكية (أي على مستوى السكان بأكمله). علاوة على ذلك ، تتم مقارنة هذه الحويصلات الداخلية ب ISGs كمرجع للهياكل دون الخلوية في “حالة ثابتة” ، أي حالة يظل فيها متوسط الخصائص الهيكلية / الديناميكية لجميع سكان الحبيبات ثابتا في أي وقت من الأوقات. يحدد Macropinocytosis سلسلة من الأحداث التي بدأتها إعادة التنظيم الشامل (أو الكشكشة) لغشاء البلازما لتشكيل بنية خارجية ذات خلايا عمينية كبيرة يتم استيعابها بعد ذلك16. الماكروبينوسومات المشكلة في المراحل المبكرة تشبه إلى حد كبير البلعمة. في الوقت نفسه ، يمكن تمييزها عن الأشكال الأخرى من الحويصلات الداخلية بسبب حجمها الكبير المميز ، وعدم التجانس المورفولوجي ، ونقص هياكل معطف البروتين.
وكشفت الفحوص البيوكيميائية أنه عند الاستيعاب، يتم إثراء الماكروبينوسومات تدريجيا بعلامات البروتين لمسارات الخلايا الداخلية الأخرى، مما يشير بدوره إلى أن هوياتها تتغير باستمرار أثناء الاتجار17. باستخدام الأجسام المضادة ضد العلامات المعروفة للمسار الإندوسومي، ثبت أن الماكروبينوسومات تتبنى تدريجيا السمات الإندوسومية الكلاسيكية: فهي تتضاءل في الحجم، وتتطور إلى هياكل إندوسوماتيكية متأخرة (مثل الليزوسومات)، أو تفقد هويتها في نهاية المطاف عن طريق الاسترجاع بوساطة الغشاء لعلامات جزيئية محددة (على سبيل المثال، فرز الروابط)18،19 . السيناريو العام هو أن كل ماكروبينوسوم داخل الخلية يغير بشكل لا رجعة فيه هويته الهيكلية والديناميكية (وكذلك الجزيئية) أثناء الاتجار من غشاء البلازما إلى مصيره النهائي داخل الخلايا. ونتيجة لذلك ، فإن الخصائص الهيكلية / الديناميكية / الجزيئية لجميع سكان الماكروبينوسومات تتغير أيضا على طول نفس المسار الزمني. وبما أن طريقة iMSD حساسة في جوهرها لمتوسط خصائص جميع السكان من الأجسام المرصودة، فإنها تصور كميا “الطبيعة المتطورة” من خلال التحديد الكمي للمعلمات المتوسطة الرئيسية، أي الانتشار المحلي والمعامل الشاذ (الخصائص الديناميكية) ومتوسط حجم الماكروبينوسومات (الخاصية الهيكلية) في أي مرحلة من مراحل الاتجار بها داخل الخلايا.
وللمقارنة، أجريت قياسات مماثلة على هيكل مغلق داخل الخلايا معروف جيدا، وهو ISG، في نموذج للخلايا β. مثل الماكروبينوسومات ، فإن تنظيم الخصائص الهيكلية والديناميكية ل ISGs ، من نشأتها في شبكة Trans Golgi (TGN) إلى إفرازاتها في غشاء البلازما ، أمر محوري للتنفيذ السليم لوظيفة ISG20. ومع ذلك ، على عكس الماكروبينوسومات ، تعيش ISGs في “حالة ثابتة” ، حيث توجد في أي وقت جميع المراحل الوظيفية / الهيكلية / الجزيئية لعمر ISG في وقت واحد داخل الخلية ، ويتم تمثيل كل منها بمجموعة فرعية محددة من ISGs. وهذا يعني أنه على الرغم من أن كل حبيبة واحدة تتطور بشكل لا رجعة فيه من التخلق الحيوي إلى الإفراز ، فمن المتوقع أن يظل متوسط الخصائص الهيكلية / الديناميكية لجميع سكان الحبيبات ثابتا في أي نقطة زمنية (ما لم يتم تغيير ظروف الحالة الثابتة ، على سبيل المثال ، بواسطة محفزات خارجية مثل الجلوكوز والكوليسترول والسيتوكينات13). وهذا ما يؤكده تحليل iMSD.
Protocol
Representative Results
Discussion
خصائص ومزايا iMSD واضحة عند مقارنتها بالتقنيات المتاحة لاسترداد المعلومات المماثلة. للحصول على المعلومات الهيكلية ، فإن الخيار المفضل هو تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). بهذه الطريقة ، يمكن استرداد التفاصيل فوق الهيكلية بدقة جزيئية وحتى خارجها ، حتى بالنسبة للهياكل النانوية دون الخلوية. ومع ذلك ، يتم تحقيق الدقة المكانية الغريبة ل TEM على حساب المعلومات في البعد الزمني ، وهو أمر مهم هنا. وللتعويض عن ذلك، فإن التطورات الأخيرة في تقنيات تصوير الخلايا الحية ذات أهمية خاصة. وتشمل هذه العلامات الفلورية الجديدة مع زيادة الأداء (على سبيل المثال ، السطوع والاستقرار الضوئي) ، وإجراءات وضع العلامات المحسنة ، وأجهزة الكشف الأكثر حساسية. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر أدوات تحليلية لمعالجة كل من التحليل الهيكلي (على سبيل المثال، “الحجم” عن طريق التحليل القائم على الطور للتحليل الطيفي المحلي لارتباط الصورة، PLICS23، التجميع/قلة القلة بواسطة تحليل العدد والسطوع24) والديناميكية (على سبيل المثال، قانون الانتشار عن طريق تتبع الجسيمات المفردة، أي (SPT)25،26،27،28 ) المعلمات على المقياس تحت الخلوي. تتيح طريقة SPT الوصول المباشر إلى مسار الكائن و MSD الخاص به. ومع ذلك ، فإن العيب هو الحاجة إلى كثافة منخفضة للمسبار وتسميات ساطعة للغاية والعديد من مسارات الجسم الواحد التي يجب قياسها لتلبية المعايير الإحصائية. وفيما يتعلق بالاستبانة الزمنية للقياس، يمكن للمجسات غير العضوية والقابلة للتصوير الضوئي (مثل النقاط الكمومية أو الجسيمات النانوية المعدنية) أن تزيد من أداء SPT ولكن على حساب إجراءات الإنتاج ووضع العلامات المعقدة.
بالمقارنة مع هذه المعايير ، تظهر طريقة iMSD الموضحة هنا بعض المزايا الرئيسية. أولا ، يمكن استخدام هذا النهج بالاقتران مع علامات الفلورسنت الخافتة نسبيا ، مثل البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا (على سبيل المثال ، التطبيق على ISGs). وبالتالي ، بالمقارنة مع SPT ، يتم تحقيق دقة زمنية أعلى (باستخدام نفس الملصق) بسبب انخفاض كمية الفوتونات المطلوبة8. ثانيا ، تقتصر طريقة iMSD فقط على الدقة الزمنية ولكن ليس الحيود . في الواقع ، على الرغم من الإعداد البصري المحدود للحيود المستخدم ، يمكن قياس متوسط الإزاحة الجزيئية حتى أقل من حد الحيود ، كما هو موضح بالفعل للتدفقات الجزيئية باستخدام STICS29. تعتمد الدقة الفعلية في قياس الإزاحة على مدى دقة (من حيث الإشارة إلى الضوضاء) التي يمكن قياس دالة الارتباط ، مما يفسر سبب عدم تقييدها بالحيود . وبالتالي ، يبدو من الواضح أن الحد الأدنى للإزاحة التي يمكن قياسها يعتمد على انتشار الكائن محل الاهتمام والدقة الزمنية لإعداد التصوير.
في هذا الصدد ، من المهم اعتبار أن التطبيق على الهياكل النانوية دون الخلوية ، مثل الماكروبينوسومات أو حبيبات الأنسولين ، باستخدام المجهر الضوئي بالليزر هو الأمثل: سرعة المسح المتاحة أعلى بكثير من ديناميكيات الكائن محل الاهتمام. في مثل هذه الحالة ، تكون حركة الكائنات أثناء الاستحواذ ضئيلة ، ويمكن تقريب دالة الارتباط بواسطة دالة Gaussian. وأخيرا، يمكن تطبيق نهج iMSD بسهولة على مجموعة واسعة من إعدادات الفحص المجهري البصري التجاري استنادا إلى المسح النقطي أو التصوير القائم على الكاميرا واسعة المجال، دون الحاجة إلى معايرة النظام (مطلوب فقط إذا كان من الضروري تحقيق تقدير دقيق لحجم الجسيمات). معلمة مهمة لطريقة العمل هي أخذ العينات المكانية المناسبة. كقاعدة عامة ، للوصول إلى تقارب مرض لخوارزمية التركيب ، يجب أن يكون الحد الأدنى لحجم المنطقة ذات الأهمية للتصوير أكبر ب 3 مرات على الأقل من الحد الأقصى لإزاحة الاهتمام.
في الختام ، لا تتطلب طريقة iMSD سوى مجهر مجهز للاكتساب السريع. يمكن وضع علامة على بنية الاهتمام لأي فلوروفور مشفر وراثيا أو عضوي ، مما يتيح التصوير متعدد القنوات. ومن المتوقع أن يستخدم التحليل عبر iMSD في المستقبل القريب لاختيار المجموعات الفرعية للهياكل النانوية دون الخلوية والكشف عن تفاعلاتها وانتشارها المشترك داخل الخلية، وهذا الأخير هو موضوع ساخن في الفيزياء الحيوية الخلوية. إذا فقدت أي تفاصيل عن طريق تحليل iMSD ، فإن هذا يرتبط بالتأكيد بالكمية الكبيرة من المعلومات الجزيئية داخل الهياكل النانوية الديناميكية تحت الخلوية. يتم حتما حساب متوسط هذه المعلومات أثناء القياس بسبب ضعف الدقة الزمنية. من الناحية النظرية ، ومع ذلك ، لا يوجد حد تقني بسبب إمكانية استرداد المعلومات الجزيئية ، شريطة أن يكون من الممكن تحقيق سرعات اكتساب كافية8. نظرا للتحسينات المستمرة في سرعة / حساسية الكاشف وتقنيات التصوير ، من المتوقع أن يتم استخراج المعلومات حول المقصورة تحت الخلوية بأكملها ومكوناتها الجزيئية من مجموعة بيانات واحدة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا العمل تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 866127 ، مشروع CAPTUR3D).
Materials
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
| C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
| DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
| FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
| HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
| Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
| Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
| Matlab | MathWork | Software | |
| Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
| Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |
References
- Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
- Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
- Mellman, I., Yarden, Y. Endocytosis and cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (12), 016949 (2013).
- Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
- Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
- Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
- Hu, Y. -. B., Dammer, E. B., Ren, R. -. J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
- Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
- Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
- Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
- Durso, W., D’Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
- Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
- Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
- Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
- Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, 4758-4769 (2006).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, 3967-3980 (2006).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
- Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
- Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
- Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
- Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
- Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
