Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

1. Transplantasyon cihazının montajı ve kullanılması Transplantasyon cihazının montajı. Luer ucunu 25 μL gaz geçirmez şırınga ve bir mikropipette tutucuyu, transplantasyon cihazını monte etmek için Luer kilit bağlantı elemanı ile bağlayın (Şekil 1A).NOT: Luer ucunu ince bir su filmi ile ıslatmak, parçaları su yapışıklığı ve uyum yoluyla bir arada tutarak bağlantıyı artırmaya yardımcı olabilir. Cihazı doğrudan manuel bir mikromanipülatöre monte etme (Şekil 1B). Cihaz sadece baskın elle kontrol edilebilir ve diğer eli ek görevler için serbest bırakır. Transplantasyon iğnesi hazırlanıyor. Bir mikropipette çekme ile cam kılcal pipet (filamentsiz) çekerek bir transplantasyon iğnesi üretin. Keskin kenarlar, embriyo için ölümcül olan nakil yaparken yumurta sarısını çizme şansını artırdığından, iğnenin ucunu mümkün olduğunca pürüzsüz bir şekilde kırın.NOT: Ucu stereomikroskop altında düz kenarlı bir jiletle kolayca kırılabilir. Bununla birlikte, bir mikroforge kullanmak, istenen boyutta hassas bir açıklık oluşturulmasını sağlar. Ektopik kaynak üretimi için yaklaşık 50-60 μm dış çap uygundur. Ekstürpasyonlar ve germline nakli için, iğnenin dış çapı, nakledilen hücre sayısını artırmak için yaklaşık 80-90 μm ölçülmelidir. Kullanıma hazır iğneyi transplantasyon cihazına takın (Şekil 1A). Transplantasyon cihazını kullanarak.Mikromanipülatörü transplantasyon cihazı ile birlikte stereomikroskopun yanına yerleştirin (Şekil 1B). Pistonu çıkarın ve transplantasyon iğnesini, iğnenin ucu batırılana kadar 45° açıyla Ringer çözeltisi ile dolu transplantasyon kabına 45° açıyla 2.2.1’e üfleyin (Şekil 1B). Kılcal damar etkisi nedeniyle su iğneye hücum edecektir. Zilin çözeltilerini temizlemek için pistonu yaklaşık yarıya kadar yerleştirin ve iğnenin ince, konik kısmında sadece küçük bir su bırakın (Şekil 1C).NOT: Bu nötr konumdur ve su seviyesi orada bir süre sabit olmalıdır (>20 dk). Su seviyesi dengesizse, hava sızıyor; Luer kilit montajını yeniden bağlayın veya şırınnayı değiştirin. İlk kez bir transplantasyon iğnesi kullanırken, kurban edilen bir embriyodan yumurta sarısı çekerek ve daha sonra yumurta sarısı malzemesini tamamen dışarı atarak içini kapla. Kaplama, sonraki prosedürler sırasında hücrelerin cama yapışmasını azaltmaya yardımcı olacaktır. Donör embriyoyu iğne yardımıyla hafifçe konumlandırın ve ardından iğne açıklığı ortogonalini embriyonun yüzeyine yerleştirin (Şekil 1D).NOT: Pozisyon farklı tahliller için farklı olacaktır. Ektopik sinyal molekülü kaynak üretimi ve hücre ekstirpasyonları için, bu hayvan direğinin üst kısmı olacaktır (Şekil 1E); germline nakli için bu marj olacaktır (Şekil 1D,F). Hücreleri iğneye çekmek için yavaşça ve dikkatlice pistonu yukarı çekin.NOT: Hücreler çok hızlı bir şekilde alınırsa, zarar görebilirsiniz. Doğru yapılırsa, hücreler silindirik bir sütun olarak çıkmalıdır. Nakledilen yumurta sarısı konak embriyo için toksik olduğundan, iğneye yumurta sarısı almaktan kaçının. İstenilen sayıda hücre çekildikten sonra pistonu hafifçe aşağı iterek emiş yapmayı durdurun. İğneyi kısa ve hızlı bir hareketle yana doğru mastürbasyon yaparak embriyodan çıkarın. Ringer’ın çözümünü hücre sütununun her iki tarafına bırakın ve hücreleri iğnenin konik ucuyla sınırlayın (Şekil 1C,D).NOT: Hücre kolonunun önündeki sıvı, hücre sütununu biriktirirken konak embriyoların hücrelerini ayırmaya yardımcı olacaktır. Hücreleri Ringer’ın çözeltisiyle yıkamak için pistonu yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek kalan yumurta sarısı veya hücre kalıntılarını temizleyin – iğne daldırılmış olarak kalırken. Doğru yapılırsa, hasarsız hücreler enkaz yıkanırken bir sütunda birbirine yapışmış olarak kalacaktır.NOT: Su seviyesi iğnenin konik ucundan yükseleceğinden, bu adım sırasında büyük özen verilmelidir. Bu, hücreleri yıkamak için kullanılabilecek ani bir su akışına neden olacaktır. Bununla birlikte, su seviyesi konik ucu geçtikten sonra, pistonla ince kontrol azaltılır ve pistonun daha yavaş ve dikkatli bir şekilde hareket ettirilmesi gerekir. İğne ortogonalini konak embriyonun yüzeyine (hayvan direği veya marjı) konumlandırmak için transplantasyon çanağını baskın olmayan elle hareket ettirin (Şekil 1D-F). Hafifçe basınç uygulayın ve ardından konak embriyonun saran tabakasını delmek için hızlı ve keskin bir hareket verin. Yumurta sarısını iğneyle çizmemeye dikkat edin.NOT: Embriyoyu kuyunun duvarlarına dikkatlice sıkarak hafif basınç uygulamak embriyonun yüzey gerilimini arttırır ve böylece saran tabakanın delinmesine kolaylaşır. İğne içeri girdikten sonra, iğneyi aynı anda yavaşça geri alırken hücre sütununu embriyoya ekstrüde etmek için pistonu hafifçe itin (Şekil 1D-F). Transplantasyon iğnesini temizlemek. İğne deiyonize suya batırılırken pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek iğneyi durulayın.NOT: İğne kirli kalırsa, tekrar suyla durulamadan önce 10 M sodyum hidroksit çözeltisi ile durulayın. İğneyi daha fazla kullanım için uygun bir kutuda saklayın. 2. Zebra balığı embriyolarında salgılanan sinyal moleküllerinin ektopik kaynaklarının oluşturulması Konak ve donör embriyolarının hazırlanması. Zebra balıklarını çift veya çift yaparak taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın. 1 hücreli evre zebra balığı embriyolarını, küçük bir cam Petri kabında yaklaşık 15 dakika boyunca 0,5 mg/mL pronaz çözeltisinde 100 embriyoya kadar kuluçkaya yatırarak deforionat edin (bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması Rogers, K. W. ve ark.14 tarafından yayınlanmıştır).NOT: Alternatif olarak, embriyolar nakilden hemen önce yüksek aşamada da dekoryone edilebilir (adım 2.2), ancak bu enjekte edilen donör embriyoların ve seçilmemiş konak embriyoların ayrı ayrı dehorionasyonunu gerektirir. Embriyoları embriyo ortamına 200 mL’lik bir beherde batırın.NOT: Dekonsiyonlu blastula ve gastrula evre embriyoları çok hassastır. Maruz kaldıkları yumurta sarısı plastik yüzeylere yapışacak ve hava ile temas halinde yırtılacaktır. Bu nedenle, tamamen embriyo ortamına daldırılmış, cam pipetle aktarılmış ve agarose kaplı (embriyo ortamında% 1) plastik kaplarda veya cam Petri kaplarında tutulmalıdırlar. Embriyo ortamının çoğunu dikkatlice boşaltın ve kabı yavaşça taze embriyo ortamıyla doldurun. Bu şekilde oluşan hafif ajitasyon zayıflamış koronların giderilmesini kolaylaştıracaktır. Bu adımı 2-3 kez tekrarlayın. Aforizyonlu embriyoları cam pastör pipet kullanarak agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarın.NOT: Cam Pasteur pipet ucunu Bir Bunsen brülör alevine maruz kalarak alev almak, embriyoların zarar görmesini önlemeye yardımcı olarak kenarı eritebilir ve pürüzsüz hale getirebilir. Floresan etiketli proteini kodlayan mRNA’yı embriyoların bir alt kümesine enjekte edin (bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması Rogers, K. W. ve ark.14 tarafından yayınlanmıştır). Neredeyse homojen ifade için mRNA’yı yumurta sarısına değil hücreye enjekte edin. Enjekte edilen embriyolar donör, seçilmemiş embriyolar ise konak olarak görev yapacaktır.NOT: Enjekte edilen mRNA miktarı ve türü çalışılan sinyal molekülüne bağlı olacaktır ve genellikle 20 ila 200 pg2,4,5,6 arasında değişmektedir (ancak belirli durumlarda 1000 pg kadar yüksek olabilir4). Enjekte edilen embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı altı kuyulu bir tabağa aktarın. Embriyolar erken küre aşamasına gelene kadar 28 °C’de kuluçkaya yatırın. Ektopik kaynaklar üretmek için hücrelerin nakledilmeleri. Bir transplantasyon kabını (üçgen kama şeklindeki kuyularla, bkz. Malzeme Masası) Ringer çözeltisi (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES ile doldurun; HEPES tamponunu 4 °C’de saklayın).NOT: Ringer’ın çözeltislerindeki kalsiyum hücre yapışıklıklarını teşvik eder ve embriyonun transplantasyon prosedüründen iyileşmesine yardımcı olur. Embriyoları transplantasyon kabına aktarın. Konak ve donör embriyoları, her durumda hayvan kutbu transplantasyon iğneye doğru yönlendirilmiş olarak alternatif kolonlara yerleştirin. Transplantasyonu bölüm 1.3’te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Ektopik kaynak nakli için kaynak hücreleri hayvan direğinin tepesinden alın ve konak embriyoda aynı yere yatırın (Şekil 1E).NOT: Hücrelerin 1.3.8 adımında ayrıntılı olarak açık olduğu gibi Ringer çözeltisi ile yıkanması, ektopik kaynak üretimi için zaten salgılanan sinyal moleküllerinin ana bilgisayara taşınmamasını sağlamak için önemlidir. Kaynağın dağılmamasını sağlamak için çok fazla hücre nakletmeyin. Yaklaşık 80 μm çapında ve 100 μm uzunluğunda bir sütun birçok uygulama için uygundur. Konak embriyonun iyileşmesi için Ringer’ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin. Hücrelerin floresan stereomikroskop kullanılarak başarıyla nakledilip nakledilmediğini inceleyin (Şekil 2). İyileştikten sonra, embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı altı kuyulu bir plakaya aktarın ve 28 ° C’de kuluçkaya yatırın. 3. Hücre ekstürpasyonu ile boyut küçültülmüş embriyolar üretmek Embriyoların ekstirpasyona hazırlanması. İstenilen genotipin zebra balıklarından taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın. Embriyoları yüksek aşamaya ulaşana kadar 28 °C’de kuluçkaya yatırın. Embriyolar yüksek aşamaya ulaştığında 2.1.2-2.1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları kaynatın.NOT: Bu örnekte, hücre ekspasyonu küre aşamasında gerçekleştirilir. Buna göre, embriyolar yaklaşık 30 dk ila 1 saat daha erken kaynatılır. İsteğe bağlı: Sarısı senktial katmanın (YSL) etiketlanması.NOT: İsterseniz, hücreleri dışarı çıkarmadan önce YSL’ye floresan dekstrans enjekte edin. Bu teknik, normal embriyogenez15 için önemli olan hücre çıkarıldıktan sonra YSL’nin bozulmadan kalıp kaldığını belirlemeye izin verir. Alternatif olarak, in vitro sentezlenmiş mRNA’lar veya proteinler de YSL’ye enjekte edilebilir. Dekonsiyone embriyoları embriyo suyu ile dolu agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın. Blastoderm marjı enjeksiyon iğnesini işaret ederek embriyoları yanal olarak yönlendirin (Şekil 3A). YSL’ye 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran’ın 0,5 nL’sini enjekte edin, bu da blastoderm hücreleri ile yumurta sarısı arasında embriyonun çapının yaklaşık üçte biri derinliğinde bir bölgeyi hedefleyin. Tüm embriyoları bir sıraya enjekte edin.NOT: Enjeksiyon iğnesinin koroyonu delmesi gerekmediğinden, küçük (~4 μm) ve keskin bir açıklık avantajlıdır. Embriyoları 180° döndürün, böylece blastoderm marjının karşı tarafı enjeksiyon iğnesini işaret eder (Şekil 3A). 3.2.3 adımında açıklandığı gibi YSL’ye 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran’ın 0.5 nL’lik bir kısmını enjekte ederek embriyo başına toplam 1 nL enjeksiyon hacmi elde edin.NOT: İki taraftan enjekte etmek, YSL içinde floresan dektranın daha eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlar. Floresan stereomikroskop altında enjeksiyonun sonucunu inceleyin. Doğru yapılırsa, floresan sinyal YSL (Şekil 3B) ile sınırlanacak ve blastoderm’in hücreler arası alanında görünmez. Hücreleri dışarı çıkarma Bir transplantasyon kabını Ringer’ın çözeltisiyle doldurun (bkz. adım 2.2.1). Embriyoları transplantasyon kabına aktarın. Embriyoları hayvan kutbu ile transplantasyon iğnesi doğru yönlendirin (Şekil 3C). 1.3.5-1.3.7 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hayvan direği bölgesinden dikkatlice çıkarın, böylece blastodermi istenen boyuta düşürür. Çıkarılan hücreleri transplantasyon iğnesinden atarak atın. İşlem tamamlandıktan sonra, embriyoların iyileşmesi için Ringer’ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin. İsteğE BAĞLI: Floresan stereomikroskop altında YSL’nin bütünlüğünü inceleyin (Şekil 3D). Embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı bir plakaya aktarın ve 28 °C’de kuluçkaya yatırın. 4. Germline transplantasyonu ile maternal-zigotik mutantların oluşturulması Konak ve donör embriyolarının hazırlanması. Hem mutant hem de vahşi tip zebra balıklarından taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın. Mutant geçmişi olan zebra balıklarından elde edilen embriyolar donör, vahşi tip geçmişe sahip zebra balıklarından elde edilen embriyolar ise konak görevi görecek.NOT: Germline transplantasyonu, yetişkinliğe kadar hayatta kalan çok sayıda başarılı germline nakli sağlamak için yüksek sayıda başlangıç embriyosu (donörler için ~ 50, konaklar için ~ 500) gerektirir. Embriyoları pastör pipet kullanarak embriyo ortamına sahip agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarın.NOT: Enjeksiyonlar, verimi artırmak için kaynatmadan önce yapılır. Korondan enjeksiyon için iğnelerin kör olması ve tıkanmasını önlemek için daha büyük bir açıklığa (~ 10 μm) sahip olması gerekir. Donör embriyolara 100 ng/μL mRNA kodlama GFP’si 1 nL ile nos1 3’UTR enjekte edin. Aktarım hızını artırmak için mRNA’yı sarısına enjekte edin.NOT: Nos1 3’UTR, ilkel mikrop hücrelerindeki mRNA’yı stabilize edecek ve döllenme sonrası 1 gün görüntülendiğinde mikrop hücrelerinin güçlü bir şekilde floresan olmasına neden olacaktır10. Konak embriyolara 1 nL 0,33 mM (3 μg/μL) çıkmaz (dnd) morfoliino enjekte edin. Verimi artırmak için morfolini sarısına enjekte edin.NOT: Dnd morfotin, konak embriyonun germline’sının transplantasyondan sonra sadece donörden gelen hücrelerle doldurulmasını sağlayan ilkel mikrop hücresi oluşumunu engeller10. Enjekte edilen embriyoları embriyo ortamına sahip plastik Petri kaplarına aktarın. Embriyolar yüksek aşamaya ulaşana kadar 28 °C’de kuluçkaya yatırın. Embriyolar yüksek aşamaya ulaştığında 2.1.2-2.1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları kaynatın. Mikrop hücrelerinin nakli Bir transplantasyon kabını Ringer’ın çözeltisiyle doldurun (bkz. adım 2.2.1). Kafeinsiz küreyi kubbe evresi embriyolarına transplantasyon kabına aktarın. Hücreleri bir donör embriyodan altı farklı konak embriyoya nakletmek için konak embriyoları ve donör embriyoları alternatif kolonlara yerleştirin. Bu, belirli bir konak embriyodaki mikrop hücrelerinin başarıyla nakledilme şansını arttırır. Embriyoları kenar boşluğu ile transplantasyon iğneye doğru yönlendirin ve bölüm 1.3’te açıklandığı gibi nakli gerçekleştirin. Germline transplantasyonları için (Şekil 1D,F), kaynak hücreleri marjdan alın (ilkel mikrop hücrelerinin bulunduğu yer) ve konak embriyoda aynı yere biriktirin.NOT: Büyük bir kolonun (yaklaşık 80 μm çapında ve 600 μm uzunluğunda) nakledilmesi başarılı bir germline nakli elde etme şansını artıracaktır. Nakil tamamlandıktan sonra embriyonun iyileşmesi için Ringer’ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin.NOT: Tüm donör embriyoların homozigöz mutantlar olması beklenmiyorsa – örneğin, heterozipöz bir inkrostan kaynaklanıyorsa – konakçının nakledilen gelecekteki mikrop hattının genotipini belirlemek için transplantasyondan sonra genotiplenmeleri gerekir. Bu durumda, ele alma sırasında konak ve donör embriyoların pozisyonlarının karıştırılmasından emin olun. Hücrelerin başarıyla nakledilip nakledilmediğini incelemek için floresan stereomikroskop kullanın (Şekil 4A,B). Embriyoları 24 kuyulu agarose kaplı bir tabağa aktarın. Aynı donörden hücre alan tüm konak embriyoları aynı kuyuda gruplayın ve buna göre etiketlenin. Onları ertesi güne kadar 28 °C’de kuluçkaya yatırın. Gerekirse, donör embriyoları genotipleme için etiketli PCR şeritlerine aktarın. Başarılı germline nakilleri için tarama Floresan stereomikroskop altında başarılı germline nakilleri için konak embriyoları tarayın yaklaşık 30 h post-fertilizasyon (hpf). Mikrop hücreleri yumurta sarısı uzantısının üzerindeki olukta bulunur (Şekil 4C).NOT: Burada sunulan cihaz ve strateji ile yapılan tipik deneyler, donör embriyo başına nakledilen mikrop hücrelerini taşıyan en az bir konak embriyo elde etmek için ~% 60-% 80 başarı oranına sahip olacaktır. Önceki bir raporda ~ verimlilik10 açıklanmıştır. Varsa, donör embriyolardan yanlış genotip ile hücre alan embriyoları atın. Larvaları, standart hayvancılık koşullarına göre ve kurumsal yönergeleri izleyerek yetişkinliğe başarıyla nakledilen mikrop hücreleri ile yetiştirin.