Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

1. Montage en gebruik van het transplantatieapparaat Het in elkaar zetten van het transplantatieapparaat. Sluit de Luer tip 25 μL gasdichte spuit en een micropipettehouder met Luer-vergrendeling aan om het transplantatieapparaat te monteren (figuur 1A).OPMERKING: Het bevochtigen van de Luer-tip met een dunne film water kan helpen om de verbinding te verbeteren door de delen bij elkaar te houden via waterhechting en cohesie. Monteer het apparaat rechtstreeks op een handmatige micromanipulator (figuur 1B). Het apparaat kan alleen met de dominante hand worden bediend, waardoor de andere hand vrijkomt voor extra taken. Het voorbereiden van de transplantatienaald. Maak een transplantatienaald door een glazen capillaire pipet (zonder filament) te trekken met een micropipettetrekker. Breek de punt van de naald zo soepel mogelijk, omdat scherpe randen de kans vergroten om de dooier te krabben tijdens het transplanteren, wat dodelijk is voor het embryo.OPMERKING: De punt kan gemakkelijk worden gebroken met een scheermesje met rechte rand onder een stereomicroscoop. Het gebruik van een microforge maakt het echter mogelijk om een nauwkeurige opening van de gewenste grootte te genereren. Voor het genereren van ectopische bronnen is een buitendiameter van ongeveer 50-60 μm geschikt. Voor extirpaties en kiembaantransplantatie moet de buitendiameter van de naald ongeveer 80-90 μm meten om het aantal getransplanteerde cellen te vergroten. Steek de gebruiksklare naald in het transplantatieapparaat (figuur 1A). Met behulp van het transplantatieapparaat.Plaats de micromanipulator met het transplantatieapparaat naast een stereomicroscoop (figuur 1B). Verwijder de zuiger en laat de transplantatienaald in de met Ringer-oplossing gevulde transplantatieschaal (zie stap 2.2.1) in een hoek van 45° zakken totdat de punt van de naald is ondergedompeld (figuur 1B). Water zal door capillaire werking de naald opspuiten. Plaats de zuiger ongeveer halverwege om de oplossingen van de Ringer weg te spoelen, waardoor er slechts een klein volume water overblijft in het dunne, taps toelopende deel van de naald (figuur 1C).OPMERKING: Dit is de neutrale positie en het waterniveau moet daar een tijdje stabiel zijn (>20 min). Als het waterniveau onstabiel is, lekt de lucht; sluit de Luer-vergrendeling opnieuw aan of vervang de spuit. Wanneer u voor de eerste keer een transplantatienaald gebruikt, bedekt u de binnenkant door dooier op te trekken uit een geofferd embryo en vervolgens het dooiermateriaal volledig te verdrijven. De coating zal helpen om de hechting van cellen aan het glas tijdens volgende procedures te verminderen. Plaats het donorsembryo voorzichtig met behulp van de naald en plaats vervolgens de naaldopening orthogonaal op het oppervlak van het embryo (figuur 1D).OPMERKING: De positie zal verschillend zijn voor verschillende assays. Voor het genereren van ectopische signaalmoleculen en celuitroeiingen is dit de bovenkant van de dierpool (figuur 1E); voor kiembaantransplantatie is dit de marge (figuur 1D,F). Trek langzaam en voorzichtig de zuiger omhoog om de cellen in de naald te trekken.OPMERKING: Als de cellen te snel worden opgenomen, kunnen ze worden beschadigd. Als het goed wordt gedaan, moeten de cellen eruit komen als een cilindrische kolom. Vermijd het opnemen van dooier in de naald, omdat de getransplanteerde dooier giftig is voor het gastheerembryo. Stop de zuigkracht door de zuiger voorzichtig iets naar beneden te duwen zodra het gewenste aantal cellen is binnengetrokken. Verwijder de naald uit het embryo door de naald in een korte en snelle beweging naar de zijkant te rukken. Laat wat Ringer-oplossing aan weerszijden van de celkolom staan en beperk de cellen tot het taps toelopende uiteinde van de naald (figuur 1C,D).OPMERKING: De vloeistof voor de celkolom zal helpen om de cellen van de gastheerembryo’s uit elkaar te drijven bij het afzetten van de celkolom. Verwijder eventuele resterende dooier of celresten door de zuiger langzaam op en neer te bewegen – terwijl de naald ondergedompeld blijft – om de cellen te wassen met de oplossing van Ringer. Als het goed wordt gedaan, blijven de onbeschadigde cellen aan elkaar vastzitten in een kolom terwijl het vuil wordt weggespoeld.OPMERKING: Tijdens deze stap moet grote voorzichtigheid worden betracht, omdat het waterniveau voorbij het taps toelopende uiteinde van de naald zal stijgen. Dit zal een plotselinge instroom van water veroorzaken, dat kan worden gebruikt om de cellen te wassen. Zodra het waterniveau echter het taps toelopende uiteinde is gepasseerd, wordt de fijne controle met de zuiger verminderd en moet de zuiger langzamer en voorzichtiger worden verplaatst. Beweeg de transplantatieschaal met de niet-dominante hand om de naald orthogonaal op het oppervlak (dierlijke pool of marge) van het gastheerembryo te plaatsen (figuur 1D-F). Oefen voorzichtig lichte druk uit en geef vervolgens een snelle, scherpe beweging om de omhullende laag van het gastheerembryo te doorboren. Zorg ervoor dat u de dooier niet met de naald bekrast.OPMERKING: Het uitoefenen van lichte druk op het embryo door het voorzichtig tegen de wanden van de put te knijpen, verhoogt de oppervlaktespanning van het embryo en vergemakkelijkt zo het doorboren van de omhullende laag. Zodra de naald binnen is, drukt u voorzichtig op de zuiger om de kolom cellen in het embryo te extruderen terwijl u de naald tegelijkertijd langzaam terugtrekt (figuur 1D-F). Reiniging van de transplantatienaald. Spoel de naald door de zuiger op en neer te bewegen terwijl de naald wordt ondergedompeld in gedeïoniseerd water.OPMERKING: Als de naald vuil blijft, spoel deze dan af met 10 M natriumhydroxideoplossing voordat u deze opnieuw met water spoelt. Bewaar de naald in een geschikte doos voor verder gebruik. 2. Het genereren van ectopische bronnen van uitgescheiden signaalmoleculen in zebravisembryo’s Het voorbereiden van de gastheer- en donorembryo’s. Verzamel vers gelegde embryo’s door zebravissen te paren. Dechorioneer 1-cel stadium zebravisembryo’s door tot 100 embryo’s te incuberen in 0,5 mg / ml pronase-oplossing gedurende ongeveer 15 minuten in een kleine glazen petrischaal (een gedetailleerde beschrijving van deze procedure is gepubliceerd door Rogers, K. W. et al.14).OPMERKING: Als alternatief kunnen de embryo’s ook worden gedechorioneerd in het hoge stadium vlak voor de transplantatie (stap 2.2), maar dit vereist dat de geïnjecteerde donorembryo’s en niet-geïnjecteerde gastheerembryo’s afzonderlijk worden gedechorioneerd. Dompel de embryo’s onder in embryomedium in een bekerglas van 200 ml.OPMERKING: Dechorionated blastula en gastrula stadium embryo’s zijn zeer delicaat. Hun blootgestelde dooier hecht zich aan plastic oppervlakken en scheurt bij contact met lucht. Daarom moeten ze volledig ondergedompeld blijven in embryo-medium, overgebracht met een glazen pipet en onderhouden in ofwel agarose-gecoate (1% in embryo medium) plastic schalen of glazen petrischalen. Leeg voorzichtig het grootste deel van het embryomedium en vul het bekerglas langzaam met vers embryomedium. De milde agitatie die op deze manier wordt veroorzaakt, zal de verwijdering van de verzwakte chorionen vergemakkelijken. Herhaal deze stap 2-3 keer. Breng de gedrogeerde embryo’s met behulp van een glazen Pasteur-pipet over in een met agarose beklede injectieschaal.OPMERKING: Het ontsteken van de punt van de glazen Pasteur-pipet door deze bloot te stellen aan een Bunsen-brandervlam kan smelten en de rand gladstrijken, waardoor schade aan de embryo’s wordt voorkomen. Injecteer het mRNA dat codeert voor het fluorescerend gelabelde eiwit in een subset van embryo’s (een gedetailleerde beschrijving van deze procedure is gepubliceerd door Rogers, K. W. et al.14). Injecteer het mRNA in de cel, niet in de dooier, voor bijna homogene expressie. Geïnjecteerde embryo’s zullen dienen als donoren, terwijl niet-geïnjecteerde embryo’s als gastheren zullen dienen.OPMERKING: De hoeveelheid en het type geïnjecteerd mRNA is afhankelijk van het signaalmolecuul dat wordt bestudeerd en varieert meestal van 20 tot 200 pg2,4,5,6 (maar kan in bepaalde gevallen oplopen tot 1000 pg4). Breng de geïnjecteerde embryo’s over in een agarose-gecoate zes-well schotel gevuld met embryomedium. Incubeer bij 28 °C totdat de embryo’s het vroege bolstadium bereiken. Het transplanteren van cellen om ectopische bronnen te genereren. Vul een transplantatieschaal (met individuele driehoekige wigvormige putten, zie Materialentabel) met Ringer’s oplossing (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; bewaar de HEPES-buffer bij 4 °C).OPMERKING: Het calcium in de oplossing van Ringer bevordert de hechting van de cel en helpt het embryo te genezen van de transplantatieprocedure. Breng de embryo’s terug in de transplantatieschaal. Plaats de gastheer- en donorembryo’s in afwisselende kolommen, in elk geval met de dierenpool gericht op de transplantatienaald. Voer de transplantatie uit zoals beschreven in rubriek 1.3. Neem voor ectopische brontransplantatie broncellen van de bovenkant van de dierpool en deponeer ze op dezelfde locatie in het gastheerembryo (figuur 1E).OPMERKING: Het wassen van de cellen met ringer’s oplossing zoals beschreven in stap 1.3.8 is belangrijk voor het genereren van ectopische bronnen om ervoor te zorgen dat reeds uitgescheiden signaalmoleculen niet naar de gastheer worden overgebracht. Transplanteer niet te veel cellen om ervoor te zorgen dat de bron niet wordt verspreid. Een kolom met een diameter van ongeveer 80 μm en een lengte van 100 μm is geschikt voor vele toepassingen. Laat het gastheerembryo 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen. Onderzoek of cellen met succes zijn getransplanteerd met behulp van een fluorescentieseeromicroscoop (figuur 2). Breng na herstel de embryo’s terug naar een met agarose bedekte zesputtenplaat gevuld met embryomedium en incubeer ze bij 28 °C. 3. Het genereren van verkleinde embryo’s door celuitroeiing Embryo’s voorbereiden voor uitroeiing. Verzamel vers gelegde embryo’s van zebravissen van het gewenste genotype. Incubeer de embryo’s bij 28 °C totdat ze het hoge stadium bereiken. Dechorioneer de embryo’s zoals beschreven in stappen 2.1.2-2.1.5 wanneer de embryo’s het hoge stadium bereiken.OPMERKING: In dit voorbeeld wordt celuitroeiing uitgevoerd in het bolstadium. Dienovereenkomstig worden embryo’s ongeveer 30 minuten tot 1 uur eerder gedechorioneerd. Optioneel: Labeling van de dooiersyncytiele laag (YSL).OPMERKING: Injecteer indien gewenst fluorescerende dextrans in de YSL voordat u cellen uitroeit. Deze techniek maakt het mogelijk om te bepalen of de YSL intact blijft na celverwijdering, wat belangrijk is voor normale embryogenese15. Als alternatief kunnen in vitro gesynthetiseerde mRNA’s of eiwitten ook in de YSL worden geïnjecteerd. Gebruik een Pasteur pipet om de gedechorioneerde embryo’s over te brengen naar een met agarose bedekte injectieschaal gevuld met embryowater. Oriënteer de embryo’s zijdelings, waarbij de blastodermmarge naar de injectienaald wijst (figuur 3A). Injecteer 0,5 nL van 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran in de YSL, gericht op een gebied tussen de blastodermcellen en de dooier op een diepte van ongeveer een derde van de diameter van het embryo. Injecteer alle embryo’s binnen één rij.OPMERKING: Omdat de injectienaald niet door het chorion hoeft te prikken, is een kleine (~ 4 μm) en scherpe opening voordelig. Draai de embryo’s 180° zodat de andere kant van de blastodermmarge naar de injectienaald wijst (figuur 3A). Injecteer nog eens 0,5 nL van 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran in de YSL zoals beschreven in stap 3.2.3, wat een totaal injectievolume van 1 nL per embryo oplevert.OPMERKING: Injecteren van twee kanten zorgt voor een meer gelijkmatige verdeling van fluorescerend dextran binnen de YSL. Onderzoek het resultaat van de injectie onder een fluorescentieseomicroscoop. Indien correct uitgevoerd, zal het fluorescerende signaal beperkt zijn tot de YSL (figuur 3B) en niet zichtbaar zijn in de intercellulaire ruimte van het blastoderm. Cellen uitroeien Vul een transplantatieschaal met de oplossing van Ringer (zie stap 2.2.1). Breng de embryo’s terug naar de transplantatieschaal. Richt de embryo’s met de dierpool naar de transplantatienaald (figuur 3C). Verwijder voorzichtig cellen uit het dierpoolgebied zoals beschreven in stappen 1.3.5-1.3.7, waardoor het blastoderm tot de gewenste grootte wordt teruggebracht. Gooi de verwijderde cellen weg door ze uit de transplantatienaald te verdrijven. Zodra de procedure is voltooid, laat u de embryo’s 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen. OPTIONEEL: Onderzoek de integriteit van de YSL onder een fluorescentieseeromicroscoop (figuur 3D). Breng de embryo’s terug op een met agarose beklede plaat gevuld met embryomedium en incubeer ze bij 28 °C. 4. Het creëren van maternale-zygote mutanten door kiembaantransplantatie Voorbereiding van gastheer- en donorembryo’s. Verzamel vers gelegde embryo’s van zowel gemuteerde als wilde zebravissen. Embryo’s van zebravissen met een gemuteerde achtergrond zullen dienen als donoren, terwijl embryo’s van zebravissen met een wild-type achtergrond zullen dienen als gastheren.OPMERKING: Kiembaantransplantatie vereist een groot aantal beginnende embryo’s (~ 50 voor donoren, ~ 500 voor gastheren) om een groot aantal succesvolle kiembaantransplantaties te garanderen die overleven tot in de volwassenheid. Breng de embryo’s over in een met agarose beklede injectieschaal met embryomedium met behulp van een Pasteur-pipet.OPMERKING: Injecties worden gedaan vóór de dechorionatie om de doorvoer te verhogen. Naalden voor injectie door het chorion moeten stomp zijn en een grotere opening hebben (~ 10 μm) om verstopping te voorkomen. Injecteer de donorembryo’s met 1 nL van 100 ng/μL mRNA dat codeert voor GFP met een nos1 3’UTR. Injecteer het mRNA in de dooier om de doorvoer te verhogen.OPMERKING: De nos1 3’UTR stabiliseert het mRNA in de primordiale geslachtscellen, waardoor de geslachtscellen sterk fluorescerend zijn wanneer ze 1 dag na de bevruchting worden afgebeeld10. Injecteer de gastheerembryo’s met 1 nL van 0,33 mM (3 μg/μL) doodlopende (dnd) morfolino. Injecteer de morfolino in de dooier om de doorvoer te verhogen.OPMERKING: De dnd morpholino blokkeert primordiale kiemcelvorming, wat ervoor zorgt dat de kiembaan van het gastheerembryo na transplantatie uitsluitend wordt bevolkt met cellen van de donor10. Breng de geïnjecteerde embryo’s over in plastic petrischalen met embryomedium. Incubeer bij 28 °C totdat de embryo’s het hoge stadium bereiken. Dechorioneer de embryo’s zoals beschreven in stappen 2.1.2-2.1.5 wanneer de embryo’s het hoge stadium bereiken. Transplantatie van geslachtscellen Vul een transplantatieschaal met de oplossing van Ringer (zie stap 2.2.1). Breng de gedórioneerde bol- naar koepelstadium embryo’s over in de transplantatieschaal. Plaats de gastheerembryo’s en donorembryo’s in afwisselende kolommen om de cellen van één donorembryo naar zes verschillende gastheerembryo’s te transplanteren. Dit vergroot de kans dat geslachtscellen van een bepaald gastheerembryo succesvol worden getransplanteerd. Richt de embryo’s met de marge naar de transplantatienaald en voer de transplantatie uit zoals beschreven in rubriek 1.3. Neem voor kiembaantransplantaties (figuur 1D,F) de broncellen uit de marge (waar de primordiale geslachtscellen zich bevinden) en deponeer ze op dezelfde locatie in het gastheerembryo.OPMERKING: Het transplanteren van een grote kolom (ongeveer 80 μm in diameter en 600 μm lang) zal de kans op het verkrijgen van een succesvolle kiembaantransplantatie vergroten. Laat het embryo 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen zodra de transplantatie is voltooid.OPMERKING: Als niet van alle donorembryo’s wordt verwacht dat ze homozygote mutanten zijn – bijvoorbeeld als ze het gevolg zijn van een heterozygote incross – moeten ze na transplantatie worden gegenotypeerd om het genotype van de getransplanteerde toekomstige kiembaan van de gastheer te bepalen. Zorg er in dit geval voor dat de posities van de gastheer- en donorembryo’s niet door elkaar worden gehaald tijdens de behandeling. Gebruik een fluorescentieseomicroscoop om te onderzoeken of de cellen met succes zijn getransplanteerd (figuur 4A,B). Breng de embryo’s over in een 24-well agarose-gecoate plaat. Groepeer alle gastheerembryo’s die cellen van dezelfde donor hebben ontvangen in dezelfde put en label ze dienovereenkomstig. Incubeer ze tot de volgende dag bij 28 °C. Breng indien nodig de donorembryo’s over in gelabelde PCR-strips voor genotypering. Screening op succesvolle kiembaantransplantaties Screen de gastheerembryo’s op succesvolle kiembaantransplantaties onder een fluorescentieseeromicroscoop ongeveer 30 uur na de bevruchting (hpf). De geslachtscellen bevinden zich in de groef boven de dooierverlenging (figuur 4C).OPMERKING: Typische experimenten met het apparaat en de strategie die hier worden gepresenteerd, hebben een slagingspercentage van ~ 60% -80% om ten minste één gastheerembryo te verkrijgen dat getransplanteerde geslachtscellen per donorembryo draagt. Een eerder rapport beschreef een efficiëntie van ~10. Gooi indien van toepassing embryo’s weg die cellen hebben ontvangen van donorembryo’s met een onjuist genotype. Kweek larven met succesvol getransplanteerde geslachtscellen naar volwassenheid volgens standaard houderijomstandigheden en volgens institutionele richtlijnen.