Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Las chaperonas moleculares contribuyen a la homeostasis de las proteínas, incluido el plegamiento, el transporte y la degradación de las proteínas. Regulan varios procesos celulares y están vinculados a numerosas enfermedades como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas¹. La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una de las chaperonas más importantes cuya función depende de cambios conformacionales impulsados por la hidrólisis de ATP y la unión con proteínas cliente mediadas por sus co-chaperonas². A pesar de un potencial obvio de Hsp90 como objetivo terapéutico, ajustar su función representa un gran desafío. Hay varios inhibidores de Hsp90 dirigidos a la región de unión a ATP N-terminal, que han sido evaluados en ensayos clínicos, pero ninguno de ellos ha sido aprobado para su comercialización³. Debido a la falta de un bolsillo de unión al ligando bien definido^4,apuntar a la región C-terminal de Hsp90 ha tenido un éxito limitado⁴. Recientemente, la interrupción de las interacciones Hsp90-cochaperona por moléculas pequeñas se ha investigado como una estrategia alternativa⁵. Apuntar a las interacciones Hsp90-cochaperona no provocaría una respuesta general al estrés celular y brinda la posibilidad de regular específicamente varios procesos intracelulares. El pentapéptido MEEVD conservado en el extremo C de Hsp90 es responsable de la interacción con el motivo de repetición tetratricopéptido (TPR) de las co-chaperonas⁶. De las 736 proteínas que contienen motivos TPR anotadas en la base de datos de proteínas humanas, ~ 20 proteínas diferentes interactúan con Hsp90 a través de este péptido⁷. Las moléculas que compiten por la unión al péptido MEEVD interrumpirían las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas que contienen un dominio TPR. El sitio de unión al péptido tiene una estructura terciaria similar, pero la homología general entre los diferentes dominios de motivos TPR es relativamente baja^7,lo que brinda la oportunidad de identificar moléculas específicamente capaces de bloquear las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas particulares con motivos TPR. Entre estas co-chaperonas con motivos TPR, la proteína de unión a FK506 (FKBP) 51 y FKBP52 son reguladores de la señalización del receptor de hormona esteroide (SHR) e involucradas en varias enfermedades dependientes de hormonas esteroides, incluyendo cáncer, enfermedades relacionadas con el estrés, enfermedades metabólicas y enfermedad de Alzheimer⁸. Aunque FKBP51 y FKBP52 comparten > similitud de secuencia del 80%, sus funciones difieren: FKBP52 es un regulador positivo de la actividad de SHR, mientras que FKBP51 es un regulador negativo en la mayoría de los casos⁸. Por lo tanto, la identificación de moléculas, bloqueando específicamente las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52, proporciona un potencial terapéutico prometedor para enfermedades relacionadas.

Unensayo amplificado Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) fue desarrollado por primera vez en 1994 por Ullman EF et al.⁹. Ahora es ampliamente utilizado para detectar diferentes tipos de interacciones biológicas, como el péptido^10,la proteína^11,el ADN^12,el ARN¹³y el azúcar^14. En esta técnica, hay dos tipos de cuentas (diámetro 200 nm), una es la cuenta donante y la otra es la cuenta aceptora. Las biomoléculas se inmovilizan sobre estas cuentas; sus interacciones biológicas ponen en proximidad a las cuentas donantes y aceptoras. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. Debido a que el oxígeno singlete tiene una vida útil corta, solo puede difundirse hasta 200 nm. Si la perla aceptora está en proximidad, su derivado tioxeno reacciona con el oxígeno singlete generando quimioluminascencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm¹⁵. Si las interacciones biológicas se interrumpen, la cuenta aceptora y la cuenta donante no pueden alcanzar la proximidad, lo que resulta en la descomposición del oxígeno singlete y la baja señal producida.

Aquí describimos un protocolo que utiliza esta técnica para el cribado de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas TPR, especialmente FKBP51 y FKBP52. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C extremo Hsp90 están unidos a las perlas aceptoras. Las co-chaperonas TPR purificadas marcadas con GST interactúan con las perlas de donantes ligadas al glutatión. Cuando la interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y las co-chaperonas con motivos TPR une las perlas, se produce una señal amplificada(Figura 1A). Si las moléculas pequeñas examinadas pueden inhibir las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas con motivo tPR, esta señal amplificada disminuirá (Figura 1B). Su IC₅₀ se puede calcular mediante medición cuantitativa. Este protocolo se puede extender a cualquier interacción chaperona – TPR-motivo co-chaperona de interés y es de gran importancia en el desarrollo de nuevas moléculas, bloqueando específicamente la interacción entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52.

Figura 1: El principio básico de este ensayo. (A) GST-FKBP51 purificado interactúa con cuentas de donantes ligadas al glutatión. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C-terminal de Hsp90 se unen a las perlas aceptoras. La interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y el dominio TPR de FKBP51 acerca las perlas del donante y del aceptor. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. El derivado tioxeno en la perla aceptora reacciona con el oxígeno singlete y genera quimioluminescencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm. (B) Cuando las moléculas pequeñas inhiben las interacciones entre Hsp90 y FKBP51, las perlas donante y aceptora no pueden alcanzar la proximidad. Luego, el oxígeno singlete con una vida útil corta se descompone y no se produce ninguna señal detectable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.