Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (MSC) têm sido tradicionalmente estudadas para suas propriedades regenerativas, mas, mais recentemente, suas características imunoregulatórias têm estado na vanguarda. Eles interagem e regulam a atividade das células imunes. O foco deste estudo é a regulação do MSC da atividade fagocítica do macrófago. A fagocitose macrófago (MΦ) é uma parte importante da resposta do sistema imunológico inato à infecção, e os mecanismos pelos quais a MSC modula essa resposta estão sob investigação ativa. Apresentado aqui é um método para estudar a fagocitose de MΦ de partículas de zimosã não opssonizadas conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH enquanto em co-cultura com MSC. À medida que a atividade fagocítica aumenta e as partículas de zimosã rotuladas são fechadas dentro do ambiente ácido do fagolico, a intensidade de fluorescência da molécula sensível ao pH aumenta. Com os comprimentos de onda de excitação e emissão adequados, a atividade fagocítica é medida usando um espectrofotômetro fluorescente e os dados cinéticos são apresentados como alterações em unidades fluorescentes relativas durante um período de 70 minutos. Para suportar esses dados quantitativos, a mudança na atividade fagocítica é visualizada por meio de imagens dinâmicas. Os resultados utilizando este método demonstram que, quando na co-cultura, o MSC melhora a fagocitose de zymosan não opssonizado tanto ingênua quanto ifn-γ tratada MΦ. Esses dados se somam ao conhecimento atual da regulação do MSC do sistema imunológico inato. Este método pode ser aplicado em investigações futuras para delinear totalmente os mecanismos celulares e moleculares subjacentes.
Introduction
Células-tronco mesenquimais (MSC) são células progenitoras que dão origem a células de tecido conjuntivo. O MSC está presente em tecidos mamíferos adultos e pode ser isolado da medulaóssea 1. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, essas células são amplamente estudadas2. Estudos iniciais focados na regulação do MSC das células T3,4,5,6, mas mais recentemente, sua regulação das células macrófagos (MΦ), um dos principais componentes celulares da imunidade inata, tem recebido maior atenção7,8,9,10,11,12,13,14 . A importância da interação MSC-MΦ no tratamento da doença inflamatória é sublinhada pelo fato de que o esgotamento dos monócitos/macrófagos revoga os efeitos terapêuticos do MSC nos modelosanimais 8. Aqui, o foco é a interação de contato celular do MSC com MΦ. A MSC tem a capacidade de regular o fenótipo de MΦ promovendo a mudança de respostas inflamatórias para anti-inflamatórias, levando a atividades de reparação tecidual8,9,10,11, e muito tem sido feito para demonstrar esses mecanismos regulatórios. Em outras circunstâncias, o MSC pode suportar ou exacerbar uma resposta inflamatória orientada por MΦ12,13 e melhorar a atividade fagocítica MΦ14,15. No entanto, há uma falta crítica de dados existentes que identifica os mecanismos pelos quais e as condições sob as quais o MSC regula a atividade fagocítica MΦ.
MΦ tem famílias de receptores que reconhecem ou o opsonizados (anticorpo ou complemento revestido) ou patógenos não opssonizados que levam à fagocitose16. A ativação e atividade deste último é menos bem estudada17. Em um ambiente in vitro não inflamatório, o MSC aprimora a fagocitose de maçom de patógenos não opssonizados13. No entanto, o reconhecimento de patógenos não opssonizados por MΦ pode ser reduzido após a exposição a um ambiente inflamatório produzido por linfócitos durante uma resposta imune adaptativa. IFN-γ, liberada por células assassinas naturais e linfócitos efeitos, tem um efeito inibidor na fagocitose de MΦ de partículas não opssonizadas18. Um modelo de cocultura foi desenvolvido para estudar os mecanismos da regulação de contato direto do MSC da fagocitose MΦ. O objetivo do experimento aqui apresentado é determinar se o MSC regula a fagocitose de mφ de patógenos não opssonizados após mΦ ter sido exposto a IFN-γ (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise da fagocitose utilizando biopartículas conjugadas a um corante sensível ao pH é uma ferramenta relativamente nova que tem se mostrado vantajosa sobre partículas tradicionais rotuladas fluorescentes12,19,20. Com partículas tradicionais rotuladas por fluorescentes, apenas a análise de ponto final é viável. A detecção é realizada com microscopia fluorescente e/ou espectrofluorometria após a lavagem ou sacieç…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo mecanismo NSF Major Research Instrument sob números de subvenções 1626093 e 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
