Régulation mésenchymateuse des cellules souches de la phagocytose des macrophages; Quantification et imagerie
Summary
Présenté ici est un protocole pour quantifier et produire des images dynamiques de la régulation médiée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la phagocytose des macrophages (MΦ) des particules de levure non opsonisées (zymosan) qui sont conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH.
Abstract
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont traditionnellement été étudiées pour leurs propriétés régénératrices, mais plus récemment, leurs caractéristiques immunorégulatrices ont été à l’avant-garde. Ils interagissent avec et régulent l’activité des cellules immunitaires. L’objectif de cette étude est la régulation MSC de l’activité phagocytaire des macrophages. La phagocytose des macrophages (MΦ) est une partie importante de la réponse du système immunitaire inné à l’infection, et les mécanismes par lesquels les CSM modulent cette réponse sont à l’étude active. Présenté ici est une méthode pour étudier la phagocytose MΦ de particules de zymosan non opsonisées conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH en co-culture avec MSC. À mesure que l’activité phagocytaire augmente et que les particules de zymosan marquées sont enfermées dans l’environnement acide du phagolysosome, l’intensité de fluorescence de la molécule sensible au pH augmente. Avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées, l’activité phagocytaire est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent et les données cinétiques sont présentées sous forme de changements dans les unités fluorescentes relatives sur une période de 70 minutes. Pour étayer ces données quantitatives, le changement de l’activité phagocytaire est visualisé à l’aide de l’imagerie dynamique. Les résultats utilisant cette méthode démontrent que lorsqu’ils sont en co-culture, les CSM améliorent la phagocytose MΦ du zymosan non opsonisé de MΦ naïf et γ traité par IFN. Ces données s’ajoutent aux connaissances actuelles sur la régulation MSC du système immunitaire inné. Cette méthode peut être appliquée dans de futures recherches pour délimiter complètement les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules progénitives qui donnent naissance à des cellules du tissu conjonctif. Les CSM sont présents dans les tissus des mammifères adultes et peuvent être isolés de la moelle osseuse1. En raison de leurs propriétés immunomodulatrices, ces cellules sont largement étudiées2. Les premières études se sont concentrées sur la régulation MSC des lymphocytes T3,4,5,6 mais plus récemment, leur régulation des cellules macrophages (MΦ), un composant cellulaire majeur de l’immunité innée, a reçu une attention accrue7,8,9,10,11,12,13,14 . L’importance de l’interaction MSC-MΦ dans le traitement des maladies inflammatoires est soulignée par le fait que l’épuisement des monocytes/macrophages abroge les effets thérapeutiques du MSC dans les modèles animaux8. Ici, l’accent est mis sur l’interaction de contact cellulaire du MSC avec MΦ. Les CSM ont la capacité de réguler le phénotype de MΦ en favorisant le passage des réponses inflammatoires aux réponses anti-inflammatoires, conduisant à des activités de réparation tissulaire8,9,10,11, et beaucoup a été fait pour démontrer ces mécanismes de régulation. Dans d’autres circonstances, le MSC peut soutenir ou exacerber une réponse inflammatoire induite par MΦ12,13 et améliorer l’activité phagocytaire MΦ14,15. Cependant, il existe un manque critique de données existantes permettant d’identifier les mécanismes et les conditions dans lesquels les CSM régulent l’activité phagocytaire MΦ.
MΦ ont des familles de récepteurs qui reconnaissent les agents pathogènes opsonisés (anticorps ou enrobés de complément) ou non opsonisés conduisant à la phagocytose16. L’activation et l’activité de ce dernier sont moins bien étudiées17. Dans un environnement in vitro non inflammatoire, les CSM améliorent la phagocytose MΦ des agents pathogènes non opsonisés13. Cependant, la reconnaissance des agents pathogènes non opsonisés par MΦ peut être réduite après une exposition à un environnement inflammatoire produit par les lymphocytes au cours d’une réponse immunitaire adaptative. L’IFN-γ, libéré par les cellules tueuses naturelles et les lymphocytes effecteurs, a un effet inhibiteur sur la phagocytose MΦ des particules non opsonisées18. Un modèle de co-culture a été développé pour étudier les mécanismes de régulation par contact direct msc de la phagocytose MΦ. L’objectif de l’expérience présentée ici est de déterminer si les CSM régulent la phagocytose MΦ des agents pathogènes non opsonisés après que MΦ a été exposé à l’IFN-γ(Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de la phagocytose à l’aide de bioparticules conjuguées à un colorant sensible au pH est un outil relativement nouveau qui s’est avéré avantageux par rapport aux particules traditionnelles étiquetées par fluorescence12,19,20. Avec les particules traditionnelles étiquetées par fluorescence, seule l’analyse du point final est réalisable. La détection est effectuée par microscopie fluorescente et/ou spe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le mécanisme de l’instrument de recherche majeur de la NSF sous les numéros de subvention 1626093 et 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
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