Esperimenti NMR ad alta pressione per il rilevamento di stati conformazionali a bassa pressione delle proteine
Summary
Forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per assemblare una cella ad alta pressione, impostare e registrare esperimenti NMR ad alta pressione e infine analizzare sia l’intensità di picco che i cambiamenti di spostamento chimico sotto pressione. Questi esperimenti possono fornire preziose informazioni sui percorsi di ripiegamento e sulla stabilità strutturale delle proteine.
Abstract
L’alta pressione è un metodo di perturbazione ben noto che può essere utilizzato per destabilizzare le proteine globulari e dissociare i complessi proteici in modo reversibile. La pressione idrostatica guida gli equilibri termodinamici verso lo stato o gli stati con il volume molare inferiore. L’aumento della pressione offre, quindi, l’opportunità di sintonizzare finemente la stabilità delle proteine globulari e gli equilibri di oligomerizzazione dei complessi proteici. Gli esperimenti NMR ad alta pressione consentono una caratterizzazione dettagliata dei fattori che governano la stabilità delle proteine globulari, i loro meccanismi di ripiegamento e i meccanismi di oligomerizzazione combinando la capacità di sintonizzazione della stabilità fine della perturbazione della pressione e la risoluzione del sito offerta dalla spettroscopia NMR della soluzione. Qui presentiamo un protocollo per sondare la stabilità di ripiegamento locale di una proteina tramite una serie di esperimenti 2D 1H-15N registrati da 1 bar a 2,5 kbar. I passaggi necessari per l’acquisizione e l’analisi di tali esperimenti sono illustrati con i dati acquisiti sul dominio RRM2 di hnRNPA1.
Introduction
È stato a lungo riconosciuto che gli stati conformazionali a più alta energia e scarsamente popolati di proteine e complessi proteici svolgono un ruolo chiave in molte vie biologiche1,2,3. Grazie a esperimenti basati su Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5e dark-state exchange saturation transfer (DEST) 6 sequenze di impulsi (tra gli altri), la spettroscopia NMR insoluzione è emersa come metodo di scelta per caratterizzare gli stati conformazionali transitori7. Insieme a questi esperimenti, possono essere introdotte perturbazioni come temperatura, pH o denaturanti chimici per aumentare la popolazione relativa di sottostati conformazionali a energia più elevata. Allo stesso modo, gli equilibri proteici possono anche essere perturbati applicando un’alta pressione idrostatica. A seconda dell’entità della variazione di volume associata ai corrispondenti cambiamenti conformazionali, un aumento della pressione da poche centinaia a poche migliaia di bar può stabilizzare significativamente uno stato energetico più elevato o causare il completo dispiegamento di una proteina8,9,10. Gli spettri NMR delle proteine mostrano tipicamente due tipi di cambiamenti con la pressione idrostatica: (i) cambiamenti di spostamento chimico e (ii) cambiamenti di intensità di picco. I cambiamenti di spostamento chimico riflettono i cambiamenti nell’interfaccia proteina superficie-acqua e/o la compressione locale della struttura proteica su una scala temporale rapida (rispetto alla scala temporale NMR)11. Crosspeaks che esibisce grandi spostamenti chimici non lineari la dipendenza dalla pressione può indicare la presenza di stati conformazionali di energia superiore12,13. D’altra parte, i cambiamenti di intensità di picco indicano importanti transizioni conformazionali su una scala temporale lenta, come i cambiamenti nelle popolazioni statali piegate / dispiegate. La presenza di intermedi ripieganti o stati energetici superiori può essere rilevata da grandi variazioni nell’entità della variazione di volume allo spiegamento misurata per diversi residui di una data proteina14,15,16,17. Sulla base della nostra esperienza, anche le piccole proteine che sono tipicamente classificate come cartelle a due stati mostrano risposte non uniformi alla pressione, il che fornisce informazioni utili sulla loro stabilità di ripiegamento locale. Qui è descritto un protocollo per l’acquisizione e l’analisi dell’intensità di picco dell’ammide e della dipendenza dalla pressione degli spostamenti chimici di 1H, utilizzando come proteina modello il motivo di riconoscimento dell’RNA isolato 2 (RRM2) della ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio descrive in dettaglio un protocollo implementato per sondare le risposte strutturali e termodinamiche delle proteine alla perturbazione della pressione. Gli esperimenti ad alta pressione registrati qui su RRM2 dimostrano che grandi variazioni nei valori di ΔVU, indicative di uno sviluppo non completamente cooperativo, possono essere trovate in una proteina a dominio singolo relativamente piccola. Un quadro simile emerge dall’analisi dei cambiamenti di spostamento chimico di 1H sotto p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal Roy J. Carver Charitable Trust a Julien Roche. Ringraziamo J. D. Levengood e B. S. Tolbert per aver gentilmente fornito il campione RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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