患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット
Summary
非常に正確な インビトロ ハイスループットアッセイシステムは、がん組織と同様に患者由来の腫瘍オルガノイド(PDU)を使用して抗がん剤を評価するために開発されましたが、96ウェルプレートと384ウェルプレートを備えた インビトロ ハイスループットアッセイシステムには適していません。
Abstract
患者由来の腫瘍オルガノイド(PPO)は、従来の細胞培養モデルよりも疾患の再現性が高い前臨床癌モデルであることが期待されている。PPOは、腫瘍組織のアーキテクチャと機能を正確かつ効率的に再現するために、さまざまなヒト腫瘍から正常に生成されています。しかし、PPOは、抗がん剤のサイズが不均一であり、培養中に大きなクラスターを形成するため、抗がん剤を評価する際に96ウェルまたは384ウェルプレートを使用した インビトロ ハイスループットアッセイシステム(HTS)または細胞分析には不適当です。これらの培養およびアッセイは、Matrigelなどの細胞外マトリックスを使用して腫瘍組織足場を作成します。そのため、PPOは、低スループットと高コストを有し、適切なアッセイシステムを開発することは困難であった。この問題に対処するために、PTOを使用して、よりシンプルで正確なHTSを確立し、抗がん剤と免疫療法の効力を評価しました。384ウェルプレートで培養された固形腫瘍から確立されたPPOを使用する in vitro HTSが作成されました。HTSはまた、96ウェルプレートで培養されたPPOを用いた免疫応答を表す抗体依存性細胞傷害活性の評価のために開発された。
Introduction
ヒトがん細胞株は、がんの生物学を研究し、抗がん剤を評価するために広く受け入れられています。しかし、これらの細胞株は、それらの形態、遺伝子変異、および遺伝子発現プロファイルが長期間にわたって培養中に変化する可能性があるため、必ずしもそれらの元の組織の元の特性を維持する必要はありません。さらに、これらの細胞株の大部分は、単層で培養されるか、またはマウス異種移植片として使用され、いずれも腫瘍組織1、2を物理的に表していない。したがって、抗癌剤の臨床有効性は、癌細胞株で観察されたものと同じではないかもしれない。そこで、患者由来の腫瘍異種移植片や患者由来の腫瘍オルガノイド(PPO)や腫瘍組織の構造や機能を正確に再現する腫瘍スフェロイドモデルを用いたex vivoアッセイなどのインビトロシステムが開発されている。証拠の増加は、これらのモデルが対応する癌組織に直接匹敵することによって抗癌剤に対する患者の反応を予測することを示唆している。これらのin vitroシステムは、異なる腫瘍組織タイプに対して確立されており、薬物スクリーニング用の関連高スループットアッセイシステム(HTS)も3、4、5、6、7に開発されている。患者または患者由来腫瘍異種移植片から得られた原発性腫瘍の異種ex vivoオルガノイド培養は、培養の容易さと、間質組織8、9、10における細胞の複雑さを維持する能力のために、近年かなりの牽引力を得ている。これらのモデルは、がんの生物学の理解を深め、インビトロでの薬物有効性の評価を促進することが期待されます。
最近、福島トランスレーショナル研究プロジェクトの下で、F-PDOに指定されたさまざまな種類の腫瘍組織から一連の新しいPDOが作成されました。PPOは、ソース腫瘍と同様の形態を有する大細胞クラスターを形成し、6ヶ月以上培養することができる11。比較組織学と包括的な遺伝子発現解析は、PPOの特徴が、培養条件下で長期増殖した後でさえ、その源腫瘍組織の特徴に近いことを示した。さらに、96ウェルおよび384ウェルプレートのPDOの種類ごとに適切なHTSが確立されました。これらのアッセイは、いくつかの分子標的剤および抗体を評価するために使用した。ここでは、子宮内膜癌に用いられる標準的な化学療法薬(パクリタキセルおよびカルボプラチン)を、パクリタキセルおよびカルボプラチンに反応しなかった患者由来のF-PDOを用いて評価した。したがって、このPDOに対するパクリタキセルおよびカルボプラチンの細胞増殖阻害活性は弱かった(IC50:>10μM)。さらに、以前の研究では、化学療法薬および分子標的剤に対するいくつかのF-PPOの感受性が臨床有効性11、12、13と一致することが報告されている。最後に、抗癌剤によって引き起こされるPPOの高次構造の変化を、3次元細胞分析システム12,13を用いて分析した。PDOベースのHTSを用いた抗癌剤の評価の結果は、これらの薬剤について得られた臨床結果と同等である。ここでは、PDOモデルを用いて抗がん剤および免疫療法の効力を評価するために使用できる、より単純で正確なHTSのためのプロトコルが提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDUの特徴は、培養中やアッセイ中に単一細胞に酵素的に分離されず、培養中の細胞クラスターを維持するということです。したがって、細胞数は顕微鏡下で正確に数えることができない。この問題を解決するために、細胞数は、50〜200μLのレベルでマークされたチューブを有する細胞を含む遠心チューブを裏打ちすることによって視覚的に決定される(図1B)。さらに、25cm2フラスコで培養した細胞クラスターのペレット体積を目視で測定することは困難であるため、通過時間は、赤から黄色への色変化が赤から黄色に変化し、単一細胞またはデブリの顕著な増加を指標として通過する時間と比較して決定した(図1A、C)。これがPPOの合格点です。PDOペレットの量は、各培地変化で遠心分離後に視覚的に測定される。ペレット体積が増加しなくなり、培地交換後の日に培地が黄色に変わると、培地は濃度で飽和していると考えられ、通過処理が行われる。ペレットの体積は、PDO ごとに定義されます。PDOが増殖しない場合、培地交換時に培地量が80%から50%に変化し、培養中にPDOの密度が増加します。
PDUに適したHTSを開発しました。そのスループットは、PDOの1つの75 cm2 フラスコを使用して行われる少なくとも10〜20の384ウェルプレートであり、1日あたりのプレートの処理数は少なくとも50です。また、PDUを用いたHTSによる各種抗がん剤の評価結果は既に報告されている。
HTSを行う場合、セル断片化や分散装置を用いたF-PPOの細量化によるメッシュフィルタの目詰まりは、フィルタのメッシュサイズを100μmに変更することで、最初に対処される。次のステップは、ガラス容器に塗布されるPDO懸濁液の体積を減らすことである。HTS用の被験物質溶液を調製する場合、低分子化合物は通常ジメチルスルホキシドに溶解し、抗体はリン酸緩衝生理食塩水に溶解する。被験物質として適切な溶媒を用い、使用した溶媒から制御データが得られる。
以下は、アッセイデータの変動性に対処する方法の説明です。384ウェルプレートを用いた試験データに大きなばらつきがある場合は、アッセイプレートを96ウェルプレート形式に変更する必要があります。PDO希釈係数(シード細胞クラスター数)も、プレートを播種した後に調べる。最後に、細胞のピッキングおよびイメージングシステムは、アッセイのためのPTOのサイズを選択するために使用することができる。チャンバにPPOを追加する前に、PPOを正しく認識できるように、単一細胞および小細胞クラスターを低速遠心分離によって除去する必要があります。チャンバにPPOを加えた後に単一細胞または小細胞クラスターが見える場合、複数の分散を行って単一細胞を除去することができます。次に、細胞のピッキングおよびイメージングシステムは、プレートを暖かく保つ機能を有するが、この機能は、システムが長期間働いているときに培養培地が蒸発するため使用されない。最後に、セルクラスタの体積は平面イメージによって認識されるため、不明です。さらに、複数の PDO が重複している場合、1 つの PDO が正しく認識されません。ただし、移動後にスキャンした画像でチェックすることで、削除機能を使用して不要なPPOを削除することができます。
電気インピーダンス測定器は、一般に、細胞増殖時のインピーダンスの変化を監視するために、接着対象癌細胞に使用されます。したがって、非接着性PPOのセルインデックスの変化は検出されません。この問題を解決するためには、PDOの種類に応じてPDO密度や酵素処理(細胞解離酵素や処理時間)などの播種条件を調べる必要があります。プレート内のウェルは、PPOを播種するための適切な細胞外マトリックスでコーティングする必要があります。PDOの種類に応じて、PDOは酵素処理なしで播種されます。RLUN007は、PPOを酵素処理で分散させた後、96ウェルプレートにPPOを播種してインピーダンスを測定するために使用されました。RLUN007を37°Cで20分間細胞培養解離試薬で処理し、細胞を分散させ、96ウェルプレートのウェルに取り付けました。解約されたRLUN007細胞が即座に凝集体を形成することを考えると、ストレーナーを使用して濾過した直後にプレートにシードすることが望ましい。細胞懸濁液をチューブからリザーバに移した後、貯留槽を2~3回ゆっくりと右から左に移動させ、プレートに播種する前に5回上下にパイプを入れた。懸濁液はウェルに添加する各々と混合した。プレートは、30分間(PPO用)または15分間(NK細胞用)の生物学的安全キャビネットに置かれ、細胞がウェル内に均等に分配されるようにしました。第2の重要な点は、抗体およびNK細胞による治療は、細胞指数が高原に達し、値が0.5以上になる前に、時間を計るべきである。RLUN007の場合、メッキ後のアッセイ開始に最適な時間は20~22時間で、播種用のセル数は5×104セル /ウェルです。
一般に、腫瘍オルガノイドの培養およびアッセイは、Matrigelなどの細胞外マトリックスを使用して、トリプシンやコラゲラーゼなどの腫瘍組織足場または酵素を作成してオルガノイド3、4、5、6、7を破壊する。この方法の利点は、培養およびアッセイ(電気インピーダンス測定器を用いたアッセイを除く)の間に細胞外マトリックスや酵素処理が必要とされない点で、人件費やコストを大幅に削減できる点です。さらに、この方法はHTSアッセイシステムや各種測定システムに比較的容易に適応できます。しかし、細胞外マトリックスの使用は、細胞の足場として機能し、組織における形態形成、分化、およびホメオスタシスに影響を与える可能性があるため、いくつかの研究目的で望ましい。
本研究では、EGFR阻害剤に臨床的に感受性を有するEGFR突然変異(L858R)を有するPPO(RLUN007)及びEGFR遺伝子の高発現(データは示されていない)を用いて、EGFR阻害剤を評価した。EGFR阻害剤に対するRLUN007の感受性は、他の肺癌由来F-PPO13の感度よりも高いことが実証された(図4)。したがって、腫瘍組織の特性を保持するPPOを用いたHTSは、潜在的な抗癌剤の評価に優れ、薬物評価の機会と個別化医療の進歩を提示する。HTSは薬剤の初期スクリーニングには適しているが、腫瘍微小環境を再現しないため、生体内での薬物の有効性を評価できない。そこで、動物モデルがない場合に血管内皮細胞や他の間質細胞や臓器オンチップ技術との共培養により生体内のヒト腫瘍組織を模倣できるインビトロシステムが開発中である。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究で使用される臨床標本を提供した患者さんに感謝します。本研究は、福島県のトランスレーショナル研究プログラムの助成金により支援されています。
Materials
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
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