תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל
Summary
מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה פותחה להערכת תרופות נגד סרטן באמצעות אורגנוידים של גידול שמקורם במטופל (PDOs), בדומה לרקמות סרטן אך אינן מתאימות למערכות במבחנה עם 96-well ו-384-well.
Abstract
אורגנוידים סרטניים שמקורם בחולה (PDOs) צפויים להיות מודל פרה-אקליני לסרטן עם רבייה טובה יותר של מחלות מאשר מודלים מסורתיים של תרבית תאים. PDOs נוצרו בהצלחה ממגוון גידולים אנושיים כדי לשחזר את הארכיטקטורה והתפקוד של רקמת הגידול בצורה מדויקת ויעילה. עם זאת, PDOs אינם מתאימים עבור מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה (HTS) או ניתוח תאים באמצעות 96-well או 384-well צלחות בעת הערכת תרופות נגד כי הם הטרוגניים בגודל וליצור אשכולות גדולים בתרבות. תרבויות וביקורות אלה משתמשות במטרישות חוץ-תאיות, כגון מטריגל, כדי ליצור פיגומים של רקמת הגידול. לכן, PDOs יש תפוקה נמוכה ועלות גבוהה, וזה כבר קשה לפתח מערכת בדיקת מתאים. כדי לטפל בבעיה זו, HTS פשוט ומדויק יותר הוקם באמצעות PDOs כדי להעריך את העוצמה של תרופות נגד ואימונותרפיה. אין ויטרו HTS נוצר המשתמש PDOs הוקמה גידולים מוצקים תרבית 384-היטב צלחות. HTS פותח גם להערכת פעילות ציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים כדי לייצג את התגובה החיסונית באמצעות PDOs בתרבית לוחות 96-well.
Introduction
קווי תאים סרטניים אנושיים מקובלים ללמוד את הביולוגיה של הסרטן ולהעריך סוכני נגד סרטן. עם זאת, קווי תאים אלה אינם בהכרח משמרים את המאפיינים המקוריים של רקמת המקור שלהם מכיוון שהמורפולוגיה, המוטציה הגנטית ופרופיל ביטוי הגנים שלהם יכולים להשתנות במהלך התרבות לאורך תקופות ארוכות. יתר על כן, רוב קווי התאים האלה מתורבתים בשכבת מונו-שכבתית או משמשים כקסנוגרפטים מורינים, שאף אחד מהם לא מייצג פיזית רקמת גידול1,2. לכן, היעילות הקלינית של סוכני נגד סרטן לא יכול להיות זהה לזה שנצפו בשורות תאים סרטניים. לכן, במערכות הפריה, כגון בדיקות ex vivo באמצעות קסנוגרפטים גידול שמקורם בחולה או organoids גידול נגזר המטופל (PDOs) ומודלים כדוריים גידול לשחזר במדויק את המבנה והתפקוד של רקמות הגידול, פותחו. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמודלים אלה מנבאים את תגובת המטופלים לסוכני סרטן על ידי השוואה ישירה לרקמת הסרטן המתאימה. מערכות במבחנה אלה הוקמו עבור סוגים שונים של רקמות הגידול, ומערכות בדיקת תפוקה גבוהה הקשורות (HTS) לבדיקת תרופות פותחו גם3,4,5,6,7. תרביות האורגנויד האקס ויואו הטרוגניות של גידולים ראשוניים המתקבלים מחולים או גידולים שמקורם בחולים צברו תאוצה ניכרת בשנים האחרונות בגלל קלות התרבות שלהם ויכולתם לשמור על המורכבות של תאים ברקמה סטרומית8,9,10. מודלים אלה צפויים לשפר את ההבנה של הביולוגיה של הסרטן ולהקל על הערכת יעילות התרופה במבחנה.
סדרה של PDOs חדשני נוצרו לאחרונה מסוגים שונים של רקמת הגידול, המיועד F-PDO, תחת פרויקט המחקר התרגומי Fukushima. PDOs ליצור אשכולות תאים גדולים עם מורפולוגיה דומה לזו של הגידול המקור והוא יכול להיות תרבית במשך יותר משישה חודשים11. ההסטולוגיה ההשוואתית וניתוחי ביטוי הגנים המקיפים הראו כי התכונות של מחשבי ה- PDOs קרובות לאלו של רקמות הגידול המקור שלהם, גם לאחר צמיחה ממושכת בתנאי תרבות. יתר על כן, HTS מתאים הוקם עבור כל סוג של PDO ב 96-well ו 384-טוב צלחות. בבדיקות אלה נעשה שימוש כדי להעריך כמה סוכנים ממוקדים מולקולריים ונוגדנים. כאן, כימותרפיה סטנדרטית (paclitaxel ו carboplatin) המשמש לסרטן רירית הרחם הוערכו באמצעות F-PDOs נגזר חולה שלא הגיב paclitaxel ו carboplatin. בהתאם לכך, הפעילות מעכבת צמיחת התא של paclitaxel ו carboplatin נגד PDO זה היה חלש (IC50: >10 מיקרומטר). בנוסף, מחקרים קודמים דיווחו כי הרגישות של כמה F-PDOs לסוכנים כימותרפיים וסוכנים ממוקדים מולקולריים עולה בקנה אחד עם היעילות הקלינית11,12,13. לבסוף, שינויים במבנה בסדר גבוה יותר של PDOs הנגרמים על ידי סוכני נגדים נותחו באמצעות מערכת ניתוח תאים תלת מימדית12,13. תוצאות ההערכה של סוכני נגד נגד דיכאון באמצעות HTS מבוסס PDO דומים עם התוצאות הקליניות שהושגו עבור סוכנים אלה. כאן, פרוטוקול מוצג עבור HTS פשוט ומדויק יותר שניתן להשתמש בו כדי להעריך את העוצמה של סוכני נגד נגדים ואימונותרפיה באמצעות מודלים PDO.
Protocol
Representative Results
Discussion
המאפיין הייחודי של PDOs הוא שהם אינם מופרדים באופן אנזימטי לתאים בודדים במהלך תרבית או תימורת ושמירה על אשכולות תאים בתרבות. לכן, לא ניתן לספור במדויק את מספר התאים תחת מיקרוסקופ. כדי לפתור בעיה זו, מספר התאים נקבע חזותית על ידי רירית צינור צנטריפוגה המכיל את התאים עם צינורות המסומנים ברמות עבור 50-200 μL (איור 1B). יתר על כן, מכיוון שקשה למדוד את נפח הגלולה של צבירי תאים בתרבית בבקבוק2 ס”מ חזותית, זמן המעבר נקבע באמצעות שינוי הצבע הבינוני מאדום לצהוב והעלייה הבולטת בתאים בודדים או בפסולת עם זמן המעבר כאינדיקטורים (איור 1A,C). זו הנקודה של העברת PDOs. כמות כדורי PDO נמדדת חזותית לאחר צנטריפוגה בכל שינוי בינוני. כאשר נפח הכדור מפסיק לעלות, והבינוני הופך לצהוב ביום שלאחר החלפה בינונית, המדיום נחשב רווי בצפיפות, והעברתה מתבצעת. עוצמת הכדור מוגדרת עבור כל PDO. אם ה-PDOs אינם מתרבים, כמות המדיום משתנה מ-80% ל-50% בזמן החילוף הבינוני, וצפיפות ה-PDOs גדלה בתרבות.
HTS מתאים PDOs פותח. התפוקה שלו היא לפחות 10 עד 20 צלחות 384-well המבוצעות באמצעות בקבוקון אחד 75 ס”מ2 של PDO, ומספר הצלחות המעובדות ליום הוא לפחות 50. בנוסף, תוצאות ההערכה של תרופות נגד נגדים שונים על ידי HTS באמצעות PDOs כבר דווחו.
בעת ביצוע HTS, סתימת מסנן הרשת הנגרמת על-ידי כריית F-PDOs באמצעות פיצול התא וציוד הפיזור מטופלת בתחילה על-ידי שינוי גודל הרשת של המסנן ל- 100 מיקרומטר. השלב הבא הוא להפחית את נפח השעיית PDO החל על כלי הזכוכית. בעת הכנת פתרונות חומר בדיקה עבור HTS, תרכובות במשקל מולקולרי נמוך מומסים בדרך כלל דימתיל גופרתי, ואת הנוגדנים מומסים מלוחים פוספט-חוצץ. הממס המתאים משמש כחומר הבדיקה, ואת נתוני הבקרה מתקבלים מן הממס בשימוש.
להלן תיאור של אופן ההתמודדות עם השונות בנתוני ה- assay. אם יש שונות גדולה בנתונים במבחן באמצעות לוחות 384-well, יש לשנות את צלחת הבדיקה לפורמט צלחת 96-well. גורם הדילול PDO (מספר אשכולות תאים זרעים) נבדק גם לאחר זריעת הצלחת. לבסוף, ניתן להשתמש במערכת איסוף והדמיה של תאים כדי לבחור את הגודל של PDOs לבדיקה. לפני הוספת PDOs לתא, יש להסיר תאים בודדים ואשכולות תאים קטנים על-ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי שתוכל לזהות כראוי PDOs. אם תאים בודדים או אשכולות תאים קטנים גלויים לאחר הוספת PDOs לתא, ניתן לבצע פיזורים מרובים כדי להסיר את התאים הבודדים. לאחר מכן, למרות שלמערכת איסוף התאים וההדמיה יש פונקציה המאפשרת לשמור על הצלחת להתחמם, פונקציה זו אינה משמשת בגלל אידוי של מדיום התרבות כאשר המערכת עובדת במשך תקופה ארוכה של זמן. לבסוף, אמצעי האחסון של אשכולות תאים אינו ידוע מכיוון שהוא מזוהה על-ידי תמונה מכוונת. יתר על כן, אם שני PDOs או יותר חופפים, PDO יחיד לא ניתן לזהות כראוי. עם זאת, ניתן להסיר PDOs לא רצויים באמצעות פונקציית הסרה על ידי בדיקת אותם על התמונה הסרוקה לאחר המהלך.
מכשיר מדידת העכבות החשמליות משמש בדרך כלל לתאי סרטן יעד חסידים כדי לפקח על שינויים בעמעמה במהלך התפשטות התאים. לכן, לא זוהה שינוי באינדקס התאים של PDOs שאינם דבקים. בניסיון לפתור בעיה זו, יש צורך לחקור את תנאי הזריעה כגון צפיפות PDO וטיפול אנזימטי (אנזים דיסוציאציה של תאים וזמן הטיפול) בהתאם לסוג PDO. בארות בצלחת חייב להיות מצופה גם עם מטריצה חוץ תאית מתאימה עבור PDOs זריעה. PDOs הם זרעים ללא טיפול אנזימטי, בהתאם לסוג של PDO. RLUN007 שימש למדידת המכשול על ידי זריעת PDOs על צלחת 96 באר לאחר פיזור אותם על ידי טיפול אנזימטי. RLUN007 טופל עם ריאגנט דיסוציאציה תרבית התא במשך 20 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לפזר את התאים ולחבר אותם לבארות של צלחת 96-באר. בהתחשב בכך שתאי RLUN007 מנותקים יוצרים מיד אגרגטים, רצוי לזרוע על הצלחות מיד לאחר סינון באמצעות מסננת. לאחר העברת ההשעיה של התא מהצינור למאגר, המאגר הועבר בעדינות מימין לשמאל פעמיים עד שלוש פעמים והוצמד למעלה ולמטה חמש פעמים לפני זריעתו על הצלחת. ההשעיה הייתה מעורבת גם עם כל תוספת לבאר. לאחר מכן הונחה הצלחת בארון בטיחות ביולוגי למשך 30 דקות (עבור PDOs) או 15 דקות (לתאי NK) כדי לאפשר לתאים להפיץ באופן שווה בבאר. הנקודה החשובה השנייה היא כי טיפול בנוגדנים ותאי NK צריך להיות מתוזמן להתרחש לפני מדד התא מגיע לרמה ואת הערך הוא לא פחות מ 0.5. במקרה של RLUN007, הזמן האופטימלי להתחיל את ההסתה הוא 20-22 שעות לאחר ה ציפוי, ומספר התא לזרוע הוא 5 x 104 תאים / טוב.
באופן כללי, התרבות והביקורת עבור organoids הגידול להשתמש מטריצות חוץ תאיות כגון מטריג’ל כדי ליצור פיגומים רקמת הגידול או אנזימים כגון טריפסין קולגנאז כדי לשבש את organoids3,4,5,6,7. היתרון של שיטה זו הוא שאין צורך במטריצה חוץ-תאית או בטיפול אנזימטי במהלך התרבות והבדיקה (למעט מבדיקות באמצעות מכשיר מדידת העכבות החשמליות), מה שמפחית באופן משמעותי את דרישות העבודה והעלויות. יתר על כן, שיטה זו קלה יחסית להתאמה למערכות בדיקת HTS ומערכות מדידה שונות. עם זאת, השימוש במטריצה חוץ תאית רצוי למטרות מחקר מסוימות מכיוון שהוא יכול לשמש כפיגומים לתאים ולהשפיע על מורפוגנזה, בידול והומאוסטזיס ברקמות.
במחקר זה, PDOs (RLUN007) עם מוטציה EGFR (L858R) כי הוא רגיש קלינית מעכבי EGFR וביטוי גבוה של הגן EGFR (נתונים לא הראו) שימשו להערכת מעכבי EGFR. הוכח כי הרגישות של RLUN007 למעכבי EGFR הייתה גבוהה יותר מזו של F-PDOs אחרים שמקורם בסרטןריאות 13 (איור 4). לכן, HTS באמצעות PDOs, אשר שומרים על המאפיינים של רקמת הגידול, הוא עדיף על הערכה של סוכנים נגד נגדים פוטנציאליים ומציג הזדמנויות להערכת תרופות והתקדמות ברפואה מותאמת אישית. למרות HTS מתאים להקרנה הראשונית של סוכנים, זה לא לשחזר את microenvironment הגידול ולכן לא יכול להעריך את היעילות של תרופות ב vivo. לכן, מערכת במבחנה שיכולה לחקות רקמת גידול אנושית ב- vivo על ידי תרבית משותפת עם תאי אנדותל וסקולריים ותאים סטרומיים אחרים או טכנולוגיית איברים על שבב בהיעדר מודלים של בעלי חיים נמצאת כעת בפיתוח.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחולים שסיפקו את הדגימות הקליניות המשמשות במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מתוכנית המחקר התרגומית של מחוז פוקושימה.
Materials
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
