다중 모달 위상 변화 포피린 방울의 합성 및 특성화
Summary
이 프로토콜에서는 다중 모달 상변경 포피린 물방울을 합성하고 특성화하는 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
위상 변화 물방울은 충분한 음향 에너지의 적용과 함께 시상에서 에코겐 마이크로 버블로 변환 할 수있는 초음파 조영제의 클래스입니다. 물방울은 마이크로 버블 보다 작고 더 안정적입니다. 그러나, 전통적인 초음파 조영제는 음향 피드백 측정을 넘어 추적할 수 없으며, 이는 정량화 조영제 바이오 분배 또는 축적 전 생체 내 비보를 어렵게 만든다. 연구원은 바이오 분포를 추론하기 위하여 형광 또는 광학 흡수성 동반자 진단 입자에 의지해야 할 지도 모릅니다. 이 프로토콜의 목적은 응축 방법을 사용하여 다중 모달 위상 변화 포르피린 방울을 만들기 위한 단계를 자세히 설명하는 것입니다. 포르피린은 뚜렷한 흡광도 대역을 가진 형광 분자로 지질에 결합하고 액적 의 다양성을 확장하기 위해 액적에 통합되어 음향 특성을 유지하면서 보다 강력한 바이오 분배를 가능하게 합니다. 다양한 포르피린 지질 및 염기 지질 함량을 가진 7개의 제형이 마이크로버블 및 액적 크기 분포를 조사하기 위해 만들어졌습니다. 포르피린 함유 구조에 적합한 특성화는 또한 그들의 분석 다기능성 내 용액을 입증하기 위해 프로토콜에 설명되어 있다. 크기 조정은 응축 된 후 평균 직경이 전구체 인구보다 1.72 ~ 2.38 배 작다는 것을 보여주었습니다. 흡수성 특성화는 그대로 어셈블리가 700nm의 Q밴드 피크를 보였고, 중단된 시료는 671nm에서 흡광도 피크를 가졌다. 형광 특성화는 그대로 30% 포르피린 지질 어셈블리가 형광액(>97%)으로 나타났으며, 혼광 회복은 중단시 달성되었다. 음향 기화는 포르피린 방울이 낮은 압력에서 비 반향적이며 충분한 압력을 가진 에코제닉 마이크로 버블로 변환될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 특성화는 생체 내 또는 전 비오에서전달 또는 치료 응용을 위한 초음파 조영제 바이오 분배를 정량화하기 위한 흡광도 또는 형광기반 동반자 진단 전략의 필요성을 제거하기 위해 포르피린 액적물의 가능성을 보여준다.
Introduction
초음파 화상 진찰은 음향파를 이용하는 의학 화상 진찰의 비 침습적이고 비 이온화 양식입니다. 초음파 스캐너는 더 휴대성이 있고 실시간 심상을 제공할 수 있지만 초음파 이미징은 낮은 대비로 고통받을 수 있으므로 초음파 검사기가 유사하게 반향 병리학적 특징을 구별하기가 어렵습니다. 이러한 한계를 중화하기 위해 마이크로버블을 숙주에 주입하여 혈관 대비를 개선할 수 있습니다. 마이크로버블은 음향파에 매우 반향이 많으며 향상된 용기 대비1,2를제공할 수 있는 미크론 크기의 가스 충전 콘트라스트에이전트이다. 마이크로버블의 쉘 및 가스 코어는 이미징, 혈전용증, 세포막 투과성, 또는 과도 혈관개구부 2와같은 다양한 용도에 맞게 조정할 수 있다.
마이크로 버블의 단점은 짧은 순환 반감기입니다. 예를 들어, 임상적으로 이용 가능한 퍼플루트렌 지질 마이크로스피어는 1.3분의반감기만 3. 긴 이미징 세션의 경우 마이크로 버블의 여러 주사가 필요합니다. 마이크로 버블의 또 다른 단점은 큰 직경입니다. 퍼플루트렌 지질 마이크로스피어는 직경이 약 1~3μm정도이지만, 혈관에서 순환할 수 있을 만큼 작지만, 너무 커서 종양4와같은 관심 있는 조직에 수동적으로 축적된다. 이러한 한계를 극복하기 위한 한 가지 전략은 가스 코어 마이크로버블을 더 작은 액체 코어 방울5,6로압축하는 것입니다. 물방울은 액체 상태에서 반향이 없지만, 충분히 높은 피크 음압으로 초음파에 노출되면 마이크로 버블로 기화 할 수 있으며 대비를 제공하는 능력을 회복할 수 있습니다. 이를 통해 액적액은 작은 액체 코어의 더 유리한 약동학을 활용할 수 있게 해주며,화학조성물4,7을변경하지 않고 음송될 때 대비를 제공하는 능력을 유지한다.
Decafluorobutane는 기체 및 액체 상태 사이 위상 이동을 위한 이상적인 퍼플루오로카본화합물5,6,7. Decafluorobutane는 온도 감소 혼자있는 방울로 마이크로 버블의 응축을 허용하지만, 덜 조밀 한 perfluorocarbons 추가 가압을 필요로하는 반면5. 이 부드러운 방법은 응축7,8,9동안 기포의 파괴를 최소화합니다. 그들의 코어는 액체이기 때문에, 물방울은 비 반향이고 초음파에 보이지 않습니다. 그러나 충분한 음향 또는 열 에너지를 적용하면 액체 코어가 기체 상태로 다시 기화하여 반향 마이크로버블8을생성할 수 있다. 이 기화는 마이크로 버블을 생성할 시기와 장소를 제어할 수 있습니다.
액적은 수동 축적에 유용하지만, 시투 기화 또는 세포 투과성 향상4,액적(및 그 조각)은 전 비보를이미지화하거나 정량화할 수 없다. 따라서 형광4,10,11,자기입자(12)및 광학흡수제(13)와같은 정량화 가능한 동반자 진단제는 관심 있는 조직에 대한 액적 전달을 측정하는 아날로그로 활용된다. 예를 들어, 헬필드 등은 마우스 장기의 조직화 를 위해 형광 나노구슬을 공동 주입하여 액적4를 검출할 수없었다. 동반자 진단 에이전트의 단점은 추적 가능한 구성 요소는 개별 약동 성 프로파일에 따라 액적으로부터 독립적으로 작용할 수 있다.
다행히도, 마이크로 버블과 물방울의 껍질을 사용자 정의 할 수 있습니다. 예를 들어, Huynh 등은 포르피린 지질 껍질로 초음파 조영제, 다중 모달마이크로버블(14)을생성했다. 포르피린은 방향족 거시동화구조(14,15)를가진 유기 화합물의 클래스이다. 그(것)들은 광학적으로 흡수성, 형광, 및 방사선 요법을 위한 금속의 넓은 다양성으로 응치될 수 있고, 방사선 종종 기지를 둔 화상 진찰, 또는 미량 금속 기지를 둔 정량화14. 포르피린의 한 가지 예는 파이로페포비드(파이로)이다. 파이로를 지질에 접목시킴으로써, 마이크로버블이나 방울에 파이로 지질을 통합하여 음향, 형광, 흡광도14등여러 모달을 통해 이미지를 만들고 추적할 수 있다. 이 다중 모달 조영제는 축적을 추적하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이렇게 하면 정량화 가능한 성분이 쉘에 수렴되어 보다 정확한 전달정량화(16)를가능하게 하므로 동반자 진단 에이전트의 필요성이 제거될 수 있다.
본명, 다중 모달 상변경 포피린 방울을 만들기 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 초음파 대조제로서 종양2,4와같은 관심 있는 조직에 약물 전달을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있으며, 초음파를 넘어 검출가능성을 확대하면 전달 효능 정량화에 유용할 수 있다. 이러한 물방울의 목적은 생체 내,시상 기화 및 음향에서 수동 축적이 가능한 추적 가능한 초음파 조영제와 이차 센서에 의존하지 않고 전 생체 기관에서 생체 분포 또는 축적을 정량화할 수 있는 잠재력을 제공하는 것입니다. 특성화 방법은 또한 바이오 분배 센서로서 포르피린 물방울의 잠재력을 보여주기 위해 설명되어 있습니다. 쉘의 파이로 지질 적재 효과(어금니 비율에 의해 0%~50%)도 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 지질 성분(1.2단계 및 1.4.5, 도 1A)을함께 추가한 후 클로로폼 및 메탄올의 용액(및 DSPA와 같은 인산 지질이 존재하는 경우 물)을 첨가하여 파이로 지질 및 비파이로 지질 성분이 완전히 균질화되었는지 확인하였다(1.5단계, 도 1B). 이질지질 조성물로 지질 소포의 형성을 방지하기 위해 용존지질은 박막(도1C)으로서바이알 벽의 내부로 건조및 코팅하였다. 코팅(1.6단계)은 또한 건조필름의 표면적을 증가시키기 때문에 수분공급(2.1단계 ~ 2.4단계)을 더 쉽게 만든다. 건조(1.6단계, 도 1C)및 진공 청소기(1.8단계, 도 1D)는이러한 화학 물질이 마이크로버블의 형성을 방해할 수 있기 때문에 클로로폼과 메탄올이 완전히 증발되도록 하였다. 프로토콜을 축소하여 지질 용액 볼륨을 1mL로 낮게 만들 수 있지만, 볼륨이 클수록 유리병에서 유리병 간 변형이 감소할 수 있습니다. 이것은 사용하지 않는 동안 파이로-SPC를 저하시키는 위험을 실행할 수 있지만, 지질 용액의 저장 상태 (2.9 에서 2.10 단계)는 그 위험을 줄이기위한 것이었습니다. 가스 교환기(2.9.2단계, 도 1F 및 도 2)를사용하여 탈기 단계는 산화를 방지하기 위해 가능한 한 많은 산소를 제거하는 역할을 한다. 대기 가스가 용액에 용해되는 동안 포르피린 지질을 함유한 지질 용액을 저장하는 것이좋습니다(도 1E).
2.10 단계에서, 지질 용액은 가압 된 헤드 스페이스를 가진 혈청 유리병에, 임상적으로 승인 된 초음파 조영제 perflutren 지질 마이크로 스피어가 판매되는 방법과 유사 (도 1F와유사). 내부 작업은 캡이 고무 스토퍼와 같은 부드러운 재료인 경우 파이로 지질의 존재와 기계적 동요를 통해 안정적인 마이크로 버블을 생성 할 수 없습니다 보여 주었다. 따라서, 지질 용액은 비고무 페놀 캡(단계 4.1 에서 4.4, 도 3A 및 3B)을가진 샘플 바이알로 옮겨졌다. 데바플루오로부탄 가스가 시료 바이알(4.1단계 4.4)으로 유입되었을 때, 밀도가 높은 데파플루오로부탄은 시료 바이알 헤드스페이스에서 대기공기를 대체해야 한다. 현재 파이로 지질이 고무 스토퍼로 마이크로 버블을 형성 할 수없는 이유는 알려져 있습니다. 파이로 지질이 없는 안정적인 마이크로버블은 고무 스토퍼4,7이있는 세럼 바이알에서 직접 만들 수 있습니다. 따라서, 가스 교환기를 이용하여 혈청 바이알을 탈가시키고 재가압한 다음 파이로 지질 제형4,5,6,7(“기타 프로토콜 및 데이터 참조)에 대한 혈청 바이알 자체를 교반하는 것이 좋습니다. 혈청 바이알에서 기계적으로 동요할 수 있다는 장점은 헤드스페이스가 가압될 수 있고 크기 선택은 혈청 바이알 거꾸로8을반전시킴으로써 이루어질 수 있다는 것이다. 본 프로토콜에서, 0% 파이로 지질 제제는 파이로 지질을 함유한 제형과 일치하도록 시료 바이알(Steps 4.1 ~ 4.4)으로 이송되었다. 또한, 더 긴 아킬 지질 사슬 길이로 인해 더 나은 반 데르 발스 상호 작용19로인해 더 안정적인 물방울이 발생합니다. 지질 쉘 조성물은 모든 지질 유형에 대해 시판되는 18-아실 사슬 길이에 기초하여 선택되었다. DSPE-PEG5K는 폴리에틸렌 글리콜 체인의 존재가 반발성황체력(19)을통해 구조물의 결합을 방지함에 따라 모든 제형(Step 1.1)에 통합되었다. 지질 수분 동안, 목욕 초음파 식기 목욕은 18-아실 사슬 길이 지질필름(18)을완전히 분산시킬 수 있을 만큼 충분히 높은 70°C(2.1단계)로 설정되었다. 아실 체인 길이가 길어지면 더 높은 온도가 필요합니다.
파이로 지질 하중이 높을수록 광학 흡수 및 형광 성분의 농도가 증가하며, 이는 최대화 된 포르피린 하중의 이점을 누릴 수있는 특정 응용 분야에 요구 될 수 있습니다. 그러나 파이로지질 함량이 증가함에 따라 관찰 가능한 액적 농도가 감소하고 직경이 증가합니다(도4 및 표 1). 이는 광학 형광및 흡수특성과 액적 농도 및 직경 간의 절충을 보여줍니다. 작은 새는 혈관을 통해 생체 내 축적을 위해 작은 직경을 우선시해야 하거나 고농도의 물방울을 주입해야 하는 경우, 파이로 지질 적재량을 증가시키는 것은 액적 디미터의 증가 또는 물방울 농도 감소의 가치가 없을 수 있습니다. 높은 물방울 농도 및/또는 작은 물방울 직경이 가장 중요한 경우, 유사하게 크기의 동반자 진단 에이전트는 파이로 지질 대신 고려되어야 합니다. 1% 파이로 지질 방울 농도 감소 또는 크기 증가 발생 하지 않았다 하는 동안, 1% 파이로 지질 적재 조직 배경형에서 합리적으로 감지 하기 위해 너무 낮은 수 있습니다. 그러나, 포르피린 모이티의 유연성은 저농도 응용 분야에 더 적합한 정량화의 대체 수단을 부여할 기능화를 위한 다중 옵션을 제공합니다. 예를 들어, 파이로 지질은 양손 방출 단층 촬영 영상 및 감마 계수20,또는 질량 분광법을 사용하여 미량 금속 정량화를 위한 팔라듐 또는 자기 공명영상(14)을위한 망간으로 구리-64로 응치될 수 있다.
일부 실험은 소량의 액적 용액만 필요할 수 있지만, 지질 용액의 1mL은 1.85 mL 샘플 바이알을 채우기 위해 필요하다. Goertz 외. 취급, 헤드 스페이스 압력, 액체 대 가스 비율 및 심지어 바이알 모양의 변화가 모두 마이크로 버블집단(17)에영향을 줄 수 있음을 입증하였다. 동요 및 크기 선택 시 바이알 온도도 크기 분포에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 최종 사용자가 최적화한 방법의 경우 물방울을 만들 때 가능한 한 일관성을 유지해야 합니다. 미개봉 된 물방울은 동결 (-20 °C) 나중에 해동 될 수 있지만 이것은 크기 집단에 영향을 미칠 것입니다.
지질 용액을 마이크로 버블로 활성화시키는 교반 절차는 형태학적으로 균질적으로 집단적인 집단을 생성하지 않습니다 (단계 4.6); 오히려, 샘플은 마이크로 버블, 다발성 소포, 리포솜 및 미셀18,21,22로채워져 있다. 마이크로 버블 크기는 미크론 과 나노 미터 범위에 걸쳐 있지만, 다른 구조는 크게 아래 800 nm 23. 사용되는 크기 조정 기술은 이러한 다양한 구조를 구별하지 않으며, 따라서 교반 후 마이크로 버블 샘플(Step 4.6, 도 3C)및 후 응축된 액적 샘플(Step 4.14, 도 3F)을혼합물로 가정해야 한다. 초음파 에 민감한 어셈블리 (다중 멜라 소포, 리포솜 및 미셀)는 응축 후 보존 될 가능성이 있으며 위상 변경 가능한 코어가 없기 때문에 크기를 변경하지 않습니다. 쿨터 카운터는 이러한 상이한 초분자 어셈블리를 구별할 수 없기 때문에 응축 에 따른 인구 규모의 변화는 나노스케일 구조의 일부 비율이 변환할 수 없고 그 크기의 영역에서 관찰된 인구에 기여한다는 가정하에 해석되어야 한다. 또한, 이러한 구조는 이러한샘플(14)의분광 및 형광 서명에 기여한다. 미셀, 리포솜/소포 및 물방울의 형광 및 흡수성 시그니처는모두 14의형광을 포함한 유사합니다. 따라서, 도 3C에서 3F, 도 4,PBS 희석 샘플인 도 5,및 PBS 희석 샘플에서 어셈블리의 혼합물이 있는 것을 고려하는 것이 중요하다.
크기 선택 후 응축(Step 4.9) 전에, 페시탄등(21)에 의해 설명된 바와 같이 부력 부력 어셈블리로부터 부력 포를 분리하기 위해 마이크로버블 샘플을 원심분리하여 비버블 어셈블리를 제거할 수 있다. 그러나, 이러한 크기 격리 샘플의 마이크로 버블 응축 실험은 크기 격리 절차를 사용하여 선택되는 더 큰 전구체 마이크로 버블 집단을 사용하여 더 큰 물방울을 산출한 것으로 나타났습니다(“기타 프로토콜 및 데이터” 단계 S5 후 분사 버블 및 물방울 크기 조정). 이 프로토콜로 생산된 액적의 의도된 적용은 마이크로버블4,8,액적 집단에 비해 작은 크기로 인해 수동적인 사치및 축적을 위한 플랫폼이기 때문에 가능한 한 작은 물방울 집단이 필요했다. 따라서, 이 프로토콜은 최종 해결책에 초음파 무감각 한 미겔, 리포솜 및 소포를 의미하는 경우에도 원심분리를 통해 크기로 분리되지 않은 교반 후 마이크로 버블 샘플을 사용했다. 이것은 바이오 분포에 대한 정량화 절차가 주입 된 모든 구조에 대한 신호를 파생하고 단지 물방울에 국한되지 않는다는 것을 의미합니다. 그러나 이러한 유사 크기의 구조는 주로 크기별로 지시되는 수동 메커니즘을 통해 축적될 가능성이 높기 때문에 이 플랫폼이 생체 내에서활용될 경우 발생할 수 있는 주요 추론을 변경해야 한다고 의심하지 는 않지만 이러한 모든 측면은 플랫폼을 사용할 수 있는 컨텍스트에 따라 개별적으로 고려해야 합니다. 초음파 유무에 관계없이 실험용 암을 이용한 테스트는 용액의 퍼플루오로카본 코어 어셈블리만이 초음파에 반응하기 때문에 바이오 분포의 변화에 책임이 있는 초음파 민감물인지 확인하기 위해 수행될 수 있습니다.
동요 후, 바이알은 15분 동안 쉬었고 바이알(도3C 대 3D)에서파티션이 관찰되었다. 부력을 통한 크기 선택은 활성화된 마이크로버블 용액8,17로부터더 큰 구조/기포를 제거하는 간단한 방법입니다. 이 경우 직경이 5μm를 초과하는 입자는 크기 선택 후 대부분 제거하였다(도4). 크기 선택의 범위는 크기선택(17)의지속 시간을 제어하여 조정할 수 있다. Sheeran 외. 크기 선택하지 않으면 혈관을 폐색하는 생성 된 마이크로 버블을 초래할 수 있음을 보여주었습니다8.
퍼플루오로카본은 생물학적으로 불활성7이라는장점이 있다. 데카플루오로부탄의 비등점은 -1.7°C이지만 체온보다 높지만, 37°C(도7B)에노출되면 물방울이 즉시 증발하지 않는다. 37°C에서 메타안정물인 액적물이므로, 액적을 마이크로버블7,9로기화하기 위해서는 추가음향에너지가 필요하다. Poprosky 외.가압(22)을통해 응축된 포르피린 방울을 시연했다. 이것은 덜 조밀 한 perfluorocarbons를 사용 하는 경우 실행 가능 하 고 심지어 필수적인 방법 하지만 높은 압력 과정에서 일부 거품을 파괴할 수 있습니다. 옥타플루오로프로판(C3F8)은-36.7°C의 비등점을 가지므로 물방울 응축을 위해 냉각 및 가압이 모두 필요합니다. 그러나, 가벼운 퍼플루오로카본은 덜 안정된 물방울로 이어집니다. 도디카플루오로펜탄(C5F12)은28°C의 비등점을 통해 보다 안정적인 물방울로 이어질 수 있다. 그러나, 그것은 실온에서 액체이며 기화하기 위해 더 강한 음향 에너지가 필요합니다. 따라서, 초음파 조영제의 함유 가스의 선택은 제조의 매개 변수 이외에 의도 된 생물학적 응용 프로그램의 조건을 고려해야한다. 본 프로토콜에서 응축을 위한 이소프로판올 목욕은 -15 ~ -17°C(4.7.1 단계 및 4.13단계)로 설정되었으며 다른 프로토콜은 -10°C 5,6을사용했다. 일반적인 디플루오로부탄 코어에서도 응축 온도는 부형제 조성물, 총 지질 농도 및 지질 껍질 조성에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 제형을 사용하는 경우 용액이 동결되지 않고 적절한 물방울 응축을 보장하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다.
물방울은 마이크로 버블 전구체7보다작고 더 안정적이기 때문에 특정 종양유형4,24의향상된 투과성 및 보존 효과와 같은 특정 관심 조직으로 사치화하기 위해 수동 축적 메커니즘을 더 잘 활용할 수 있습니다. 형광, 광학 흡수성 및 음향 검출방법(14)을통해, 단일 제형을 사용하여 흡수를 정량화할 수 있다. 또한,이 플랫폼은 물방울의 음향 기화가 수동 수준16을넘어 전달 된 에이전트 분획을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 주사 후 조직 및 관심 기관의 바이오 분배를 정량화하기 위해, 알려진 양의 파이로 지질 방울을 동물에 주입해야 하며, 초음파는 대조군 세트에 따라 적용될 수도 있고, 동물이 미리 지정된 시간 점을 희생해야 하며, 장기를 제거하고 계량해야 한다. 장기는 조직을 탈세포화하기 위해 계면활성제(세제)에서 균질화, 여과, 희석, 희석되어야 하며, 파이로 신호에 기초하여 장기 질량당 주입된 용량 비율을 얻기 위해 형광 또는 UV-Vis 분광법으로 정량화되어야 한다. 5.4.5 단계(도 5)및 단계 5.5.5(도 6),트리톤 X-100 계면활성제 (세제)는 410 nm에서 비형광이며 흡수파장이 파이로와 겹치지 않기 때문에 샘플을 방해하는 데 사용되었습니다.
마이크로 버블은 UV-Vis 흡광도를 특징으로하지 않았다. UV-Vis 분광의 레이저 소스가 검출기와 평행하기 때문에 큰 기포가 검출기에서 빛을 분산시켜 광학적으로 흡수성이14로나타날 수 있습니다. UV-Vis 분광광미터와 는 달리 형광 분광광측기의 검출기는 레이저 소스에 수직으로 침투하여 소스가 검출기를 방해하지 않도록 해야 합니다. UV-Vis는 손상되지 않고 손상된 액적 샘플의 흡광도를 정량화하는 데 사용되었습니다(5.4 단계, 도 5). 300~800nm는 파이로지질의 두 가지 주요 흡광도 대역, 소레밴드(340~500nm) 및 Q밴드(640~730nm)로 흡수파장으로선택되었다. 물방울(또는 다른 수퍼마분자 구조)으로 조립될 때, 파이로 지질의 Q밴드 피크는 671nm에서 700nm(그림5)로적색으로 이동한다. 이 초분자 구조가 트리톤과 같은 계면활성제에 의해 중단되면 피크는 671 nm14,15로다시 이동합니다. 이러한 변화에 따라 파이로 지질이 조립된 상태인지 또는 중단된 상태인지 알 수 있습니다. 두 피크의 비율을 사용하여 시간이 지남에 따라 어셈블리의 붕괴를 추정할 수 있습니다.
형광 측정(5.5단계, 도 6)의경우, 410nm의 포각 파장이 소레 밴드 피크에 상응하는 것으로선택되었다(14) 600nm에서 800nm까지의 방출 파장 범위가 PBS의 그대로 어셈블리의 봉우리로 선택되었으며 트리톤의 파이로 지질이 이 범위 내에 포함되어 있습니다. 변속 및증가(도 6)는손상되지 않은(PBS의 704nm) 및 중단(Triton의 674nm) 샘플 사이의 구조 유도 담금질로 인해 발생하였다. 조립된 형태로, 파이로 지질 분자는 밀접하게 함께 포장되었기 때문에 생성된 광자는 근처의 파이로 지질 분자에 의해 흡수되었습니다. 이것은 손상되지 않은 굴절 효율과 명백합니다. 따라서, 담금질을 완화하고 바이오 분배정량화(14)에대한 신호를 최대화하기 위해 1% 트리톤 X-100과 같은 계면활성제(세제)로 시료를 희석할 필요가 있다.
단순성, 동일한 선형 어레이 초음파 트랜스듀서는 기화 및 이미지 모두에 사용되었다(단계 6.5 및 6.7, 도 7). 이 초음파 트랜스듀서 (재료의 표)는 물방울8을기화하는 데 필요한 피크 음압에 도달 할 수 있었다. 수돗물에서 탈이온된 물로 탱크를 채우면 물에 용해되는 가스가 생성됩니다(6.1 단계). 기화 및 이미징을 통해 물에 용해된 가스로부터의 간섭을 최소화하기 위해, 물은 탱크에서 24시간 동안 휴식을 취하여 수중의 가스가 대기와 평형화될 수 있도록 하였다(6.1단계). 또는, 탈이온된 물은 충분히 강력한 진공에 연결된 충분히 크기의 밀봉 가능한 용기로 탈가스처리될 수 있다. 초음파 이미지는 작은 압력(도 7B)에서부적물들이 관찰 할 수없는 / 비 반향이 있었기 때문에 마이크로 버블이 성공적으로 응축되었다는 것을 입증했습니다. 물방울이 관찰 가능한 에코 생성 마이크로 버블(도 7D,7F, 7H)으로기화한 것은 더 높은 출력 압력이었습니다. 응축 후 액적 샘플에는 미셀과 리포솜/소포가 포함되어 있지만, 이러한 어셈블리는 비 에코제닉이며 물방울만이 에코제닉 마이크로버블로 기화할 수 있습니다. PBS 컨트롤은 기준선 이미지를 설정하기 위해 팬텀을 통해 흐르고(그림7A, 7C, 7E, 7G). PBS에서 압력이 증가함에 따라 대조가 발생하지 않았습니다. 이것은 트랜스듀서로부터의 고압이 단독으로 수성 매체에서 자발적인 캐비테이션을 생성할 수 없다는 것을 나타내었고, 따라서 다른 모든 생성된 콘트라스트는 채택된 초음파 조영제에 기인할 수 있었다. 출력 압력이 너무 높으면 생성된 마이크로 버블을 파괴할 수 있습니다. 점진적으로 압력을 증가시키고 생성된 대비를 관찰함으로써 최적의 압력을 찾을 수있습니다 8. 액적의 순환 반감기는 물방울을 기화하여 유사한 방법으로 결정될 수 있으며, 특정 시간 간격은 특정 시간 간격이며, 시간이 지남에 따라 생성된 콘트라스트를관찰7.
요약하자면, 다양한 파이로 지질 함량을 가진 다중 모달 위상 변화 물방울이 응축 방법으로 만들어졌습니다. 크기 조정은 파이로 지질 적재와 마이크로 버블 / 물방울 농도 사이에 절충이 있었다는 것을 보여 주었다. 특성화는 흡수성과 형광 모두에서 손상되지 않고 중단된 형태의 차이가 있음을 보여주었습니다. 초음파 화상 진찰은 물방울이 37°C에서 비 반향이고 충분한 압력에서 반향 마이크로 버블로 증발할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 특성화는 또한 Pyro 지질 물방울이 물방울 바이오 분배 또는 축적 테스트를 위해 동반자 진단 에이전트를 대체할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 향후 작업은 용액 기화 임계값, 용액 안정성 및 누드 마우스의 생체 내 순환 기간을 조사할 것입니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 브랜든 헬필드 박사에게 가스 교환기 구축을 도와준 것에 대해 감사를 표하고 있으며, Miffy Hok Yan Cheng 박사에게 기술 적인 토론을 해 주었습니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금, 캐나다 보건 연구 기관, 테리 폭스 연구소 및 공주 마가렛 암 재단 : 다음과 같은 자금 출처에 감사드립니다.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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