리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구
Summary
단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.
Abstract
리보솜은 mRNA 템플릿을 따라 공정하게 단백질을 조립하는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체입니다. 리보솜의 직경은 A-, P-및 E-사이트에서 대형 tRNA 기판을 수용할 수 있는 약 20nm이다. 따라서 리보솜 역학은 자연스럽게 빠르게 단계적 해제됩니다. 단일 분자 방법은 각각의 리보솜을 개별적으로 감지하고 다중 구성 요소 시스템의 복잡한 메커니즘을 드러내는 데 필수적인 불동성 집단을 구별할 수 있습니다. 우리는 리보솜 단백질 L27과 tRNAs 사이 리보솜 역학을 조사하기 위하여 Nikon Ti2 반전 현미경을 기반으로 smFRET 방법의 세부 사항을 보고합니다. L27은 독특한 Cys 53 위치에 표시되어 L27이 부족하도록 설계된 리보솜으로 재구성됩니다. tRNA는 팔꿈치 부위에 표시되어 있습니다. tRNA가 전지 및 전후 전좌와 같은 신장 주기 동안 리보솜 내부의 다른 위치로 이동함에 따라 FRET 효율성과 역학은 여러 하위 집단을 제안한 차이를 나타낸다. 이러한 하위 채우기는 앙상블 방법으로 는 감지할 수 없습니다. TIRF 기반 smFRET 현미경은 수동 또는 전동 반전 현미경에 내장되어 있으며 집에서 만든 레이저 조명이 있습니다. 리보솜 샘플은 초원심분리에 의해 정제되어 집에서 만든 다중 채널 샘플 셀에 로드된 다음 에반에센트 레이저 필드를 통해 조명됩니다. 반사 레이저 스팟은 완벽한 초점의 피드백 제어를 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 신호는 전동 필터 포탑으로 분리되고 두 대의 디지털 CMOS 카메라에 의해 수집됩니다. 강도는 NIS-Elements 소프트웨어를 통해 검색됩니다.
Introduction
리보솜은 큰 (50S) 및 작은 (30S) 하위 단위의 ø 20 nm 큰 리보뉴클레오단백질 복합체이다. 그것은 공정하고 협조적으로 mRNA 템플릿을 따라 긴 펩티드를 조립합니다. 리보솜 30S는 단백질 합성을 시작하기 위해fMet-tRNA fMet 및 mRNA에 결합하고, 50S는 70S 개시 복합체를 형성하기 위하여 그 때 결합합니다. tRNA는 A-사이트(아미노아실-tRNA 결합 부위)에서 리보솜에 아미노산을 가져오고, 길쭉한 펩티딜 체인은 P-site(peptidyl-tRNA 결합 부위)에서 유지된다. 전전 측부 복합체에서 펩티딜 사슬은 1개의 아미노산을 첨가한 A-사이트에서 tRNA로 전달된다. 한편, P-사이트 tRNA는 디딜레이트된다. 그런 다음 A-, P-tRNA는 P-, E-사이트로 이동하여 전자 사이트가 tRNA 출구 사이트를 나타내는 트랜스로케이션 후 복합체를 형성합니다. 이 상태에서, 펩디딜-tRNA는 P-사이트로 다시 이동한다. 신장 주기는 리보솜이 mRNA에 전·후 부적합,한번에 1개의 코돈으로 이동하면서 사전 및 사후 적합성 사이에서 계속된다. 리보솜은 서브유닛 래칫2,tRNA 혼성화 변동3,GTPase 활성화4,L1 줄기 개방 폐쇄5등과 같은 이 공정을 효율적이고 정확하게 만들기 위해 다양한 기능성 부위의 고도로 조화를 이룬다. 따라서, 리보솜은 모든 분자가 자신의 속도로 움직이기 때문에 신속하게 탈위상을 해제합니다. 종래의 방법은 명백한 평균 매개변수만 추론할 수 있지만, 인구밀도가 낮거나 수명이 짧은 종은 평균 효과6에서가려질 것이다. 단일 분자 방법은 각 리보솜을 개별적으로 검출하여 이러한 한계를 깨고 통계 적 재구성7을통해 다른 종을 식별 할 수 있습니다. tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10등 사이의 상호 작용과 같은 리보솜 역학을 조사하기 위해 상이한 라벨링 사이트가 구현되었습니다. 또한, 크고 작은 서브유닛을 각각 라벨링함으로써, 서브유닛 래칫 운동학 및 인자와의 조정이관찰된다 11,12. 한편, smFRET 방법은 다른 중앙 생물학적 과정에 광범위한 응용을 가지며, 다색 FRET 방법은13으로부상하고 있다.
이전에는 소설 리보솜 FRET 쌍이14,15를개발했습니다. 재조합 리보솜 단백질 L27은 표현, 정제 및 라벨을 부착하고 리보솜으로 다시 통합하였다. 이 단백질은 가까운 거리에서 tRNA와 상호 작용하고 전후 복합체에서 P 사이트 tRNA를 안정화하는 데 도움이되었습니다. tRNA가 A-에서 P-사이트로 이동하면 이 단백질과 tRNA 사이의 거리가 단축되어 스프렛 신호로 구별될 수 있습니다. 복수의 리보솜 하위집단은 통계적 방법 및 돌연변이발생을 이용하여 확인되었으며, 전소-전좌 복합체에서 이들 집단의 자발적교환은 리보솜이 mRNA에서 이동하기 전에 보다 유연하고, 디코딩 시 보다 경직된16,17,18을시사한다. 이러한 변화는 리보솜 함수에 필수적입니다. 여기서, 프로토콜은 리보솜/tRNA 라벨링의 세부 사항, 리보솜에 의한, smFRET 샘플 제제 및 데이터수집/분석(19)에대해 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET는 배경 신호에 민감합니다. 먼저, 시료 챔버를 0.05% 트웬으로 코팅한 다음 리보솜 용액과 동시에 첨가하여 표면에 리보솜의 비특이적 결합을 차단할 필요가 있다. 수용자 Cy5 방출에서 형광을 보기 위해 산소 제거제 칵테일 (데옥시, 포도당 및 트로록스 용액)이 필수적입니다. 이 솔루션없이, 표백은 유용한 정보를 얻기 위해 수용자 채널에서 너무 빠릅니다. 리보솜 실험을 위한 또 다른 중요한…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 국립 보건원 (R01GM111452)과 웰치 재단 (E-1721)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
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