ヒト単球様THP-1白血病細胞株を用いたM2様表現型へのマクロファージ分化と分極化
Summary
M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。
Abstract
腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、外部刺激に応じてそれらの発現およびサイトカインプロファイルを切り替えることができる。この顕著な可塑性はTAMが腫瘍の微小環境の中で進行中の変化に適応することを可能にする。マクロファージは、主に炎症促進(M1様)または抗炎症(M2様)の属性を有し、これら2つの主要な状態を継続的に切り替えることができる。腫瘍環境内のM2様マクロファージは、いくつかのタイプの癌における癌の進行および予後不良に関連している。THP-1細胞の分化と分極化を誘導するための多くの異なる方法は、細胞および細胞間のメカニズムと腫瘍の微小環境におけるTAMの影響を調べるのに使用される。現在、THP-1細胞株を用いたM2様マクロファージ偏極のモデルは確立されていないが、一定のインビトロ刺激によるマクロファージの発現およびサイトカインプロファイルの結果は研究によって異なる。このプロトコルは、THP-1単球様細胞をM0マクロファージに分化し、14日以内に細胞をさらにM2様表現型に分光するための詳細なガイダンスとして機能します。軽顕微鏡を用いて、THP-1単球様細胞、分化マクロファージ、偏光M2様マクロファージの形態変化を実証する。このモデルは、TAMの抗炎症効果と腫瘍微小環境の他の細胞集団との相互作用を調査する細胞株モデルの基礎となる。
Introduction
腫瘍関連マクロファージ(TAM)と慢性炎症におけるそれらの役割、癌の発症、および腫瘍の発達は、最近の研究1,2において重要な標的である。現像腫瘍の組織微小環境にリクルートされた末梢血単球はマクロファージに分化し、マクロファージ3の2つの主要なサブタイプに分極することができる。古典的に活性化されたマクロファージは、主に炎症促進性M1様表現型を表し、代わりに活性化されたM2様サブタイプは主に抗炎症特性4を示す。マクロファージは、細胞代謝に応じてこれら2つの主要なフェノタイプ間で動的に切り替えることができ、中間サブタイプは炎症性および抗炎症属性の両方を有する5。TAMは、両方の表現型の不均一な集団を表す。異なるタイプの癌における腫瘍促進機能と予後不良は、しかし、特にM2様マクロファージ6、7、8と関連している。
マクロファージの機能的プロファイルと腫瘍微小環境内の他の細胞との相互作用は複雑で、進行中の腫瘍の開発中に絶えず変化する環境で捕獲することは困難です。細胞株は、培養中の安定した生存率を有する均質な細胞集団を提供することができ、定義された細胞および細胞間メカニズムを実証するプロセスを容易にすることができる。単球様THP-1細胞株は、ヒト一次単球9の正当なモデルシステムである。この自発的に不死化した細胞株は、急性単球性白血病9,10を有する1歳児の末梢血から得られた。THP-1細胞の分化と分極化は、いくつかの研究によって報告されており、複数の異なる方法で行われてきた11,12,13,14.したがって、M1様表現型へのマクロファージの分極化は、代償性抗炎症反発機構を続け、インターロイキン6(IL-6)またはイタコナーテリンなどの炎症性マクロファージによって産生されるサイトカインを介してM2様表現型を促進する。これは、細胞活性化17に続く過多の炎症反応を減衰させるブレークメカニズムとして役立つ可能性がある。単球とTHP-1単球様細胞を抗炎症性M2様表現型に分化・偏光するプロセスは、それ自体が克服しなければならない炎症促進刺激を伴う。炎症サイトカイン応答は、細胞を再送する培地を変えたり、ファルボル12-ミリステアテン酸塩(PMA)などのTHP-1細胞を分化する化学化合物を添加したり、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン1β(IL-1β)またはIL-699などの機械的ストレスによって引き起こされ得る。PMAに対する応答としてこの変化したサイトカイン発現プロファイルは、マクロファージの後の分極20に影響を及ぼし、また防止することができる。PMA治療後に報告された適切な休止期間は、これらの炎症反応が減少し、細胞分極化を明確なM2様表現型21に促進することを可能にする。
このプロトコルは、THP-1単球様細胞を14日以内にM2様のマクロファージに分化し、分極する方法を示す。
Protocol
注: このプロトコルで説明されている手順の概要を図 1に示します。ヒト単球様白血病細胞株THP-1を購入した。THP-1細胞株を認証するために短いタンデム反復分析を行った。滅菌条件下ですべてのステップを実行します。THP-1単球細胞株は懸濁液で成長し、細胞培養表面に付着しない。付着は、PMAを用いた機械的ストレスまたは特異的治療を介して、単球をマクロファージ…
Representative Results
M2様マクロファージを特徴とし、分化マーカー群(CD)CD14、CD11b、CD80(M1様マーカー)、CD206(M2様マーカー)のフローサイトメトリーを用いてM2偏光を検証した。フローサイトメトリー染色は、メーカーの指示に従って行った。マクロファージをPBS/5Sで洗浄し、非特異的結合を避けるためにFcγ受容体ブロックでインキュベートした。次に、FITC結合マウス抗ヒトCD14およびCD80抗体、PE結合マウス抗ヒト…
Discussion
このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞の分化および偏光に関する方法を提供し、ステップ間の十分な休止期間を有する細胞の長い治療インキュベーションによる、明確なM2様表現型を有するマクロファージを得る方法を提供する。
このプロトコルには、特定の手順が不可欠です。THP-1単球の倍加時間は約26時間です。セルは、9 x 105/mL のセル密度で分割でき…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ルイビル大学の外科研究所は、ジョン・W・プライスとバーバラ・スラスターン・アトウッド・プライス・トラストによって財政的に支援されています。資金源は、調査の設計と実施、およびデータの収集、管理、分析、解釈において何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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Citer Cet Article
Scheurlen, K. M., Snook, D. L., Gardner, S. A., Eichenberger, M. R., Galandiuk, S. Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line. J. Vis. Exp. (174), e62652, doi:10.3791/62652 (2021).