Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica
Summary
El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.
Abstract
En la fertilización clínica in vitro (FIV), el método predominante para el PGT-A requiere la biopsia de unas pocas células del trofoectodermo (TE). Este es el linaje que forma la placenta. Este método, sin embargo, requiere habilidades especializadas, es invasivo y sufre de falsos positivos y negativos porque el número de cromosomas en el TE y la masa celular interna (MCI), que se desarrolla en el feto, no siempre son los mismos. La NICS, una tecnología que requiere la secuenciación del ADN que se libera en el medio de cultivo tanto desde TE como desde ICM, puede ofrecer una salida a estos problemas, pero se ha demostrado previamente que tiene una eficacia limitada. El presente estudio informa el protocolo completo de NICS, que incluye métodos de muestreo en medio de cultivo, amplificación del genoma completo (WGA) y preparación de bibliotecas, y análisis de datos de NGS mediante software de análisis. Teniendo en cuenta los diferentes tiempos de criopreservación en los diferentes laboratorios de embriones, los embriólogos tienen dos métodos para recolectar el medio de cultivo de embriones que se pueden seleccionar de acuerdo con las condiciones reales del laboratorio de FIV.
Introduction
Las tecnologías de reproducción asistida (TRA) se han utilizado cada vez más para el tratamiento de la infertilidad. Sin embargo, la tasa de éxito de las TRV, como la FIV, ha sido limitada, y la tasa de pérdida de embarazos es significativamente mayor que la de la población normal1. La principal causa de estos problemas son las anomalías cromosómicas, que existen comúnmente en los embriones humanos preimplantacionales2. El PGT-A es un método eficaz para evaluar el equilibrio cromosómico de los embriones antes de la implantación 3,4. Algunos estudios han demostrado que el PGT-A puede reducir la tasa de aborto y mejorar la tasa de embarazo 5,6,7,8. Sin embargo, el PGT-A requiere conocimientos técnicos complejos que requieren formación y experiencia específicas. El procedimiento invasivo de biopsia embrionaria también podría causar daño a los embriones9. Los estudios han demostrado que la biopsia de blastómeros puede dificultar el desarrollo posterior, y el número de TE biopsiadas puede afectar las tasas de implantación10. A pesar de que el problema de la biopsia embrionaria a largo plazo aún no ha sido evaluado a fondo en humanos, los estudios en animales han demostrado sus influencias negativas en el desarrollo embrionario11,12,13.
Informes anteriores indicaron que se secretaron trazas de materiales de ADN en el medio de cultivo durante el desarrollo embrionario, y se han realizado esfuerzos para realizar un cribado cromosómico completo (CCS) utilizando el medio de cultivo de embriones gastados 14,15,16,17,18. Sin embargo, las tasas de detección y la precisión de las pruebas no han cumplido con los requisitos para un uso clínico extensivo. El presente estudio reportó una mejoría en el ensayo NICS para aumentar las tasas de detección, así como la precisión de la prueba NICS19. En los últimos años, el líquido blastocelele (BF) se ha estudiado como una muestra analítica de PGT-A mínimamente invasiva. Sin embargo, la proporción de amplificación exitosa de todo el genoma y ADN detectable en muestras de líquido blastocisto oscila entre el 34,8% y el 82%20,21,22. El volumen de LM reportado en varios estudios oscila entre 0,3 nL y 1 μL. En vista de la baja cantidad de ADN en BF, es posible aumentar la cantidad de ADN libre de células mezclando líquido de blastocisto y medio de cultivo para mejorar la tasa de éxito y la consistencia de la detección. Kuznyetsov y cols.23 y Li et al.24 trataron la zona pelúcida con un láser y liberaron líquido blastocisto en el medio de cultivo para mejorar la cantidad total de ADN embrionario, y la tasa de amplificación de las muestras combinadas de medio/BF después de WGA fue del 100% y del 97,5%, respectivamente. Jiao et al.25 también obtuvieron una tasa de éxito de amplificación del 100% utilizando el mismo método.
El presente estudio reporta un protocolo detallado que incluye la preparación de la muestra de medios gastados, la preparación de NGS y el análisis de datos. Mediante la extracción cuidadosa de células cúmulos de ovocitos, el presente estudio realizó una inyección intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) y un cultivo de blastocisto. El medio gastado del día 4 al día 5 y al día 6 se recolectó para la preparación de la biblioteca WGA y NGS. Mediante el uso de la tecnología NICS, el presente estudio agilizó los pasos de preparación de la biblioteca WGA y NGS en aproximadamente 3 h y obtuvo resultados de CCS de forma no invasiva en aproximadamente 9 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificaciones y solución de problemas
Si los resultados de la NICS están contaminados con materiales genéticos parentales, asegúrese de que se eliminen todas las células del cúmulo radiata de la corona y de que se realice la ICSI para la fertilización. Se evitan los procesos inadecuados de almacenamiento en el medio o de preparación de plantillas, que pueden degradar el ADN. El espacio de trabajo se purificó a fondo con reactivos de descontaminación de DNasa y RNasa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Shiping Bo y Shujie Ma por su ayuda en el análisis de datos de NGS. Financiamiento: este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (Subvención No. 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
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