Verwendung von Baseplating und einem Miniskop, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist, für die Calcium-Transienten-Forschung bei Mäusen

Fluoreszierende Aktivitätsreporter sind ideal für die Bildgebung der neuronalen Aktivität, da sie empfindlich sind und große Dynamikbereiche ^1,2,3 haben. Daher wird in immer mehr Experimenten die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die neuronale Aktivität^direkt zu beobachten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Das erste miniaturisierte Ein-Photonen-Fluoreszenzmikroskop (Miniskop) wurde 2011 von Mark Schnitzer et ^al.5 entwickelt. Dieses Miniskop ermöglicht es den Forschern, die Fluoreszenzdynamik von Kleinhirnzellen in sich frei verhaltenden Tieren⁵ zu überwachen (d.h. ohne physische Fesselung, Kopfstütze, Sedierung oder Anästhesie der Tiere). Derzeit kann die Technik angewendet werden, um oberflächliche Hirnareale wie den Cortex 6,8,15,16 zu überwachen; subkortikale Bereiche wie der dorsale Hippocampus 8,11,13,14 und Striatum ^6,17; und tiefe Hirnareale wie der ventrale Hippocampus 14, die Amygdala 10,18 und der Hypothalamus ^8,12.

In den letzten Jahren wurden mehrere Open-Source-Miniskope entwickelt^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Das Miniskop kann von Forschern kostengünstig zusammengebaut werden, wenn sie die Schritt-für-Schritt-Richtlinien des Miniscope-Teams der University of California, Los Angeles (UCLA) befolgen^4,7,11,13. Weil die optische Überwachung der neuronalen Aktivität durch die Grenzen der Lichtdurchlässigkeit eingeschränkt ist⁷ Zu und von der interessierenden neuronalen Population wurde ein Miniskop entwickelt, bei dem eine GRIN-Linse (oder Objektivlinse) mit objektivem Gradientenbrechungsindex (oder Objektiv) an der Unterseite des Miniskops vorverankert werden muss, um das Sichtfeld zu vergrößern, das von einer Relais-GRIN-Linse (oder Relaislinse) weitergeleitet wird^{6,7,8,10,16,17}. Diese Relaislinse wird in die Zielhirnregion implantiert, so dass die Fluoreszenzaktivität der Zielhirnregion auf die Oberfläche der Relaislinse übertragen wird^{6,7,8,10,16,17}. Ungefähr 1/4 einer vollen sinusförmigen Lichtperiode wandert durch das GRIN-Objektiv (~ 0,25 Tonhöhe) (Abbildung 1A1), was zu einem vergrößerten Fluoreszenzbild führt^6,7. Das Objektiv ist nicht immer an der Unterseite des Miniskops befestigt und die Implantation der Relaislinse ist nicht immer notwendig^6,7,11,13,15. Konkret gibt es zwei Konfigurationen: eine mit einem festen Objektiv im Miniskop und eine Relaislinse, die in das Gehirn implantiert wird^{8,10,12,14,16} (Abbildung 1B1) und eine weitere mit nur einem abnehmbaren Objektiv^6,7,11,13,15 (Abbildung 1B2). In dem Design, das auf der Kombination aus festem Objektiv und implantierter Relaislinse basiert, werden die Fluoreszenzsignale aus dem Gehirn auf die Oberseite der Relaislinse gebracht (Abbildung 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Anschließend kann die Objektivlinse das Gesichtsfeld von der Oberseite der Relaislinse (Abbildung 1A2). Auf der anderen Seite ist das Design der abnehmbaren GRIN-Objektivlinse flexibler, was bedeutet, dass die Präimplantation einer Relaislinse in das Gehirn nicht zwingend erforderlich ist (Abbildung 1B2)^6,7,11,13,15. Bei der Verwendung eines Miniskops, das auf einem abnehmbaren Objektivdesign basiert, müssen die Forscher immer noch eine Linse in die Zielregion des Gehirns implantieren, aber sie können entweder eine Objektivlinse implantieren^6,7,11,13,15 oder eine Relaislinse im Gehirn^6,7. Die Wahl eines Objektivs oder einer Relaislinse für die Implantation bestimmt die Miniskop-Konfiguration, die der Forscher verwenden muss. Zum Beispiel basiert das V3 UCLA Miniscope auf einem abnehmbaren GRIN-Objektivdesign. Die Forscher können entweder eine Objektivlinse direkt in die interessierende Hirnregion implantieren und das “leere” Miniskop auf das Objektiv montieren^6,7,11,13,15 (ein Ein-Linsen-System; Abbildung 1B2) oder um eine Relaislinse in das Gehirn zu implantieren und ein Miniskop zu montieren, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist^6,7 (ein System mit zwei Linsen; Abbildung 1B1). Das Miniskop arbeitet dann als Fluoreszenzkamera, um Livestream-Bilder der neuronalen Fluoreszenz aufzunehmen, die von einem genetisch kodierten Kalziumindikator erzeugt wird^1,2,3. Nachdem das Miniskop an einen Computer angeschlossen wurde, können diese Fluoreszenzbilder auf den Computer übertragen und als Videoclips gespeichert werden. Forscher können die neuronale Aktivität untersuchen, indem sie die relativen Veränderungen der Fluoreszenz mit einigen Analysepaketen analysieren^20,21 Oder schreiben Sie ihre Codes für zukünftige Analysen.

Das V3 UCLA Miniscope bietet Anwendern die Flexibilität, zu entscheiden, ob die neuronale Aktivität mit einem Ein- oder Zweilinsensystem abgebildet werden soll⁷. Die Wahl des Aufzeichnungssystems richtet sich nach der Tiefe und Größe des Zielhirnbereichs. Kurz gesagt, ein Ein-Linsen-System kann nur einen Bereich abbilden, der oberflächlich (weniger als ca. ca. 2,5 mm tief) und relativ groß (größer als ca. 1,8 x 1,8 mm²) ist, da die Hersteller nur eine bestimmte Größe des Objektivs herstellen. Im Gegensatz dazu kann ein Zwei-Linsen-System auf jedes Zielgebiet des Gehirns angewendet werden. Der Zahnzement zum Verkleben der Grundplatte neigt jedoch dazu, bei einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse zu einer Fehlausrichtung zu führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Wenn das Zwei-Linsen-System verwendet wird, müssen zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden, um die optimale Abbildungsqualität zu erzielen (Abbildung 1A). Diese beiden kritischen Arbeitsabstände befinden sich zwischen den Neuronen und der unteren Oberfläche der Relaislinse sowie zwischen der Oberseite der Relaislinse und der Unterseite der Objektivlinse (Abbildung 1A1). Jede Fehlausrichtung oder falsche Platzierung des Objektivs außerhalb des Arbeitsabstands führt zu einem Abbildungsfehler (Abbildung 1C2). Im Gegensatz dazu benötigt das Ein-Linsen-System nur einen präzisen Arbeitsabstand. Die Größe des Objektivs begrenzt jedoch seine Anwendung für die Überwachung von tiefen Hirnregionen (das Objektiv, das zum Miniskop passt, ist ungefähr 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daher ist die Implantation einer Objektivlinse für die Beobachtung der Oberfläche und relativ großer Hirnregionen, wie z.B. des Cortex^6,15 und der dorsalen Cornu ammonis 1 (CA1) bei Mäusen^11,13 begrenzt. Darüber hinaus muss ein großer Bereich des Kortex abgesaugt werden, um das dorsale CA1^11,13 anzugreifen. Aufgrund der Einschränkung der Ein-Linsen-Konfiguration, die die Bildgebung tiefer Hirnregionen verhindert, bieten kommerzielle Miniskop-Systeme nur ein kombiniertes Objektiv-/Relaisobjektiv-Design (Zwei-Linsen-Design). Auf der anderen Seite kann das V3 UCLA Miniskop entweder in ein Ein- oder Zwei-Linsen-System umgewandelt werden, da das Objektiv abnehmbar ist 6,11,13,15. Mit anderen Worten, V3 UCLA Miniskop-Benutzer können die abnehmbare Linse nutzen, indem sie sie in das Gehirn implantieren (wodurch ein Ein-Linsen-System entsteht), wenn sie Experimente mit oberflächlichen Gehirnbeobachtungen (weniger als 2,5 mm Tiefe) durchführen oder indem sie sie im Miniskop vorverankern und eine Relaislinse in das Gehirn implantieren (wodurch ein Zwei-Linsen-System entsteht). bei der Durchführung von Experimenten mit Tiefenhirnbeobachtungen. Das Zwei-Linsen-System kann auch für die oberflächliche Beobachtung des Gehirns verwendet werden, aber der Forscher muss die genauen Arbeitsabstände zwischen der Objektivlinse und der Relaislinse kennen. Der Hauptvorteil des Ein-Linsen-Systems besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Arbeitsabstände verfehlt werden, geringer ist als bei einem Zwei-Linsen-System, da zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden müssen, um eine optimale Abbildungsqualität im Zwei-Linsen-System zu erzielen (Abbildung 1A). Daher empfehlen wir die Verwendung eines Ein-Linsen-Systems für oberflächliche Gehirnbeobachtungen. Wenn das Experiment jedoch eine Bildgebung im Bereich des tiefen Gehirns erfordert, muss der Forscher lernen, eine Fehlausrichtung der beiden Linsen zu vermeiden.

Das Basisprotokoll für die Zwei-Linsen-Konfiguration von Miniskopen für Experimente umfasst die Linsenimplantation und die Baseplattierung ^8,10,16,17. Baseplating ist das Aufkleben einer Grundplatte auf den Kopf eines Tieres, so dass das Miniskop schließlich auf dem Tier montiert werden kann und die Fluoreszenzsignale von Neuronen auf Video aufzeichnen kann (Abbildung 1B). Bei diesem Verfahren wird die Grundplatte mit Zahnzement auf den Schädel geklebt (Abbildung 1C), aber das Schrumpfen des Zahnzements kann zu inakzeptablen Veränderungen des Abstands zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse^{führen 8,17}. Ist der verschobene Abstand zwischen den beiden Linsen zu groß, können Zellen nicht scharf gestellt werden.

Detaillierte Protokolle für Experimente zur Calcium-Bildgebung im tiefen Gehirn mit Miniskopen wurden bereits veröffentlicht^8,10,16,17. Die Autoren dieser Protokolle haben das Inscopix-System verwendet^8,10,16 oder andere kundenspezifische Designs¹⁷ und haben die experimentellen Verfahren für die Virusselektion, die Chirurgie und die Grundplattenbefestigung beschrieben. Ihre Protokolle können jedoch nicht präzise auf andere Open-Source-Systeme angewendet werden, wie z. B. das V3 UCLA Miniscope-System, NINscope⁶und Finchscope¹⁹. Eine Fehlausrichtung der beiden Linsen kann während der Aufnahme in einer Zwei-Linsen-Konfiguration mit einem UCLA Miniscope aufgrund der Art des Zahnzements, der verwendet wird, um die Grundplatte mit dem Schädel zu zementieren, auftreten^8,17 (Abbildung 1C). Das vorliegende Protokoll ist erforderlich, da der Abstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse aufgrund der unerwünschten Schrumpfung von Zahnzement während des Baseplating-Verfahrens anfällig für Verschiebungen ist. Während der Grundierung muss der optimale Arbeitsabstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse gefunden werden, indem der Abstand zwischen dem Miniskop und der Oberseite der Relaislinse eingestellt wird, und die Grundplatte sollte dann an dieser idealen Stelle verklebt werden. Nachdem der richtige Abstand zwischen der Objektivlinse und der implantierten Relaislinse eingestellt wurde, können Längsmessungen mit zellulärer Auflösung (Abbildung 1B; in vivo Aufzeichnung). Da der optimale Arbeitsabstand eines Relaisobjektivs klein ist (50 – 350 μm)^4,8kann es schwierig sein, das Objektiv und die implantierte Relaislinse im richtigen Bereich zu halten. Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Protokoll zur Verringerung der Schrumpfungsprobleme bereitzustellen^8,17 die während des Baseplating-Verfahrens auftreten und die Erfolgsrate von Miniscope-Aufnahmen von Fluoreszenzsignalen in einer Zwei-Linsen-Konfiguration erhöhen. Eine erfolgreiche Miniskop-Aufzeichnung ist definiert als die Aufzeichnung eines Livestreams von auffälligen relativen Veränderungen in der Fluoreszenz einzelner Neuronen in einem sich frei verhaltenden Tier. Obwohl verschiedene Marken von Dentzement unterschiedliche Schrumpfungsraten haben, können Forscher eine Marke auswählen, die zuvor getestet wurde^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Allerdings ist nicht jede Marke in einigen Ländern/Regionen aufgrund der Einfuhrbestimmungen für medizinische Materialien leicht zu erhalten. Daher haben wir Methoden entwickelt, um die Schrumpfraten verfügbarer Zahnzemente zu testen und vor allem ein alternatives Protokoll bereitzustellen, das das Schrumpfungsproblem minimiert. Der Vorteil gegenüber dem derzeitigen Baseplating-Protokoll ist eine Erhöhung der Erfolgsrate der Calcium-Bildgebung mit Werkzeugen und Zement, die in Laboratorien leicht gewonnen werden können. Das UCLA-Miniskop wird als Beispiel verwendet, aber das Protokoll ist auch auf andere Miniskope anwendbar. In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Baseplating-Verfahren und empfehlen auch einige Strategien für den Einbau des UCLA Miniskop-Zweilinsensystems (Abbildung 2A). Sowohl Beispiele für erfolgreiche Implantation (n=3 Mäuse) als auch Beispiele für fehlgeschlagene Implantation (n=2 Mäuse) für die Zwei-Linsen-Konfiguration mit dem UCLA-Miniskop werden vorgestellt und die Gründe für die Erfolge und Misserfolge diskutiert.