הערכה רב-גורמית של התנהגות מוטורית בחולדות לאחר פציעת ריסוק עצבית סיאטית חד-צדדית

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הרשויות המקומיות ב- Regierung von Unterfranken (וירצבורג, גרמניה) ובוצעו בהתאם להנחיות הבינלאומיות, הלאומיות ו/או המוסדיות הרלוונטיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים. 1. פציעת מעיכה עצבית סיאטית הערה: לשמור על סביבה סטרילית במהלך כל ההליך הכירורגי. תארגן את שולחן הניתוחים עם הציוד הדרוש. מאוד להרדים את החולדה בארון סגור עם isoflurane 3.0% ב O2 (2 L / min). תוציא את החולדה מהארון. לגלח שטח נרחב של hindlimb הימני. מקם את החולדה לתוך מסכת הרדמה ולהמשיך הרדמה עמוקה עם isoflurane 2.0% ב O2 (2 L / min). לשלוט בעומק ההרדמה על ידי צביטת webbing interdigital של הרגליים האחוריות. היעדר רפלקסים נסיגה מצביע על הרדמה נאותה. לתקן את פלג הגוף העליון ואת שני hindlimbs של החולדה עם קלטת. מניחים את שני הישבים בתנוחה סימטרית ומושטת על ידי הפיכת הכף שטוחה על שולחן הניתוחים. יש למרוח משחה עיניים כדי למנוע עיניים יבשות. לחטא את העור של האזור מגולח עם חיטוי. חפש את החריץ הסיאטי של האיליום. הפוך חתך בעור מן חריץ sciatic לכיוון הכף עם אזמל. חתך העור צריך להיות קטן ככל האפשר (כ 1 עד 2 ס”מ). אם הישבנים האחוריים קבועים וחתך העור מבוצע כראוי, ניתן לראות חלל במישור fascial בין שריר gluteus maximus ושריר femoris שרירי הזרוע דומה “קו לבן”. הכנס מלקחיים hemostatic סופר דק סגור (מס ‘5) לתוך החלל ולהפיץ את המלקחיים. המטוס הקסאלי צריך להיפתח מבלי לפגוע ברקמת שריר. מניחים את מחזר גומי מתחת לשרירים, כדי לשמור על חתך העור פתוח. הסר בעדינות את כל הרקמות וכלי הדם שמסביב מהעצב הסיאטי עד שהעצב נחשף לחלוטין. חשוב לא למתוח או למשוך את העצב במהלך כל ההליך. מועכים את העצב הסיאטי עם מהדק לא משונן (המוסטט דק במיוחד) עם לחץ קבוע וניתן לשחזור. בשביל זה, לפתוח את המהדק, למקם את העצב על הלסת התחתונה של המהדק ולסגור את המהדק על ידי נעילתו לתנוחה הראשונה במשך שלוש פעמים עשר שניות. המיקום של ריסוק העצב הסיאטי ממוקם קרוב לחריץ הסיאטי, קרוב לאתר החלוקה של צרור העצבים הסיאטי הראשי. לאחר פציעת הריסוק, פתח מחדש את המהדק בזהירות. אתר ההידלקות של העצב הסיאטי נראה שקוף. הסר את מחזר גומיות. סגור את חתך המטוס fascial עם תפר 4-0 resorbable. סגור את החתך בעור עם סיכות עור הגוף. החל Rimadyl על פי הנחיות GV-SOLAS (5 מ”ג / קילוגרם משקל גוף, הזרקה תת עורית) להקלה על כאב לאחר הניתוח כל 24 שעות לאחר הניתוח במשך יומיים. הסר את החולדה מהגדרת הניתוח. מניחים את החולדה לתוך כלוב נקי ללא מצעים על צלחת חימום (37 מעלות צלזיוס) עד החולדה ערה. תזיז את החולדה בחזרה לכלוב הבית הנקי שלהם. הסר סיכות עור הגוף ארבעה עד שישה ימים לאחר הניתוח. 2. מבחן שדה פתוח (OFT) הערה: פעילות לוקומוטור, כמו גם פעילות התנהגותית ניתן לנתח על ידי OFT. ההתקנה הגדר את OFT (איור 1A) בסביבה חשוכה ושקטה. הוא מורכב ממערכת מעקב וידאו אוטומטית EthoVision XT (מחשב, תוכנה עם רישיון) וזירה מדידה 58.5 ס”מ (אורך) x 58.5 ס”מ (רוחב) x 45 ס”מ (גובה) עם שריטה עמיד, משטח שחור לניקוי. פני השטח השחורים חשובים כדי להגדיל את הניגודיות בעת מעקב אחר בעלי חיים לבנים. הערכה הנח את הזירה והמצלמה במיקום הנכון. התאם את המצלמה שתיבת השדה הפתוחה כולה עם הרזולוציה הטובה ביותר מוקלטת. בצע את הניסוי בסביבה חשוכה. אם יש צורך באור להתקנה, השתמש באור קטן ומפוזר כדי למנוע כתמי אור, השתקפויות וגוונים בזירה. להבטיח תנאי תאורה שווים על ידי מדידת ההארה עם מד לוקס באזורים שונים של הזירה. הגדר את תוכנת ה-XT של את’ו ויז’ן. ההגדרות החשובות ביותר מפורטות באפשרויות הבאות. בהגדרות הניסוי, בחר מעקב חי עבור מקור הווידאו וזיהוי נקודות המרכז עבור התכונות במעקב. לאמת את גודל הזירה בהגדרות ארנה. הגדר את תנאי ההתחלה של רכישת נתונים לשלוש שניות לאחר שהחולדה הוצבה במרכז הזירה ואת זמן הריצה הכולל לחמש דקות בהגדרות בקרת ניסיון. בחר חיסור סטטי עבור פעולת השירות בהגדרות זיהוי. סימן ביקורת שמור וידאו עבור פעולת שירות בהגדרות רכישה. מניחים את החולדה בעדינות באמצע זירת הבדיקות (איור 1B). לחץ על לחצן התחל גירסת ניסיון בבקרת רכישה כדי להתחיל בהקלטה. במהלך ההקלטה, התרחקו מהגדרת OFT כדי להימנע מהסחת דעת החולדה. לאחר כל משפט, להסיר את החולדה בעדינות מזירת הבדיקה ולנקות את ההתקנה עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר. ניתוח נתונים לניתוח הנתונים של OFT באמצעות תוכנת EthoVision XT, עבור אל המקטע ניתוח בסרגל הימני ובחר עקוב אחר תצוגה חזותית תחת הכרטיסיה תוצאות (איור 1C). לאחר מכן, יצא את הפרמטרים הדרושים ל- Excel. בתוך התוכנה, בחר מספר משתנים מקטגוריות שונות לניתוח נתונים. משתנים חשובים עבור מטרה מדעית ספציפית זו הם “מרחק זז” ו “מהירות” תחת הקטגוריה “מרחק וזמן”. בצע ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים שנבחרו (איור 1D). 3. ניתוח הליכה של CatWalk XT הערה: ניתוח הליכה באמצעות מערכת CatWalk XT יכול לעזור להעריך פרמטרים רבים ושונים הנוגעים לטביעות הרגליים, העמידה וההליכה של מודלים של בעלי חיים. שביל זכוכית מואר באור ירוק והאור המפוזר על ידי עקבות בעלי החיים נלכד במצלמת וידאו מהירה, הממוקמת מתחת לשביל ההליכה. ניתן לנתח את האותות באמצעות תוכנת CatWalk XT. ההתקנה לניתוח הליכה עם CatWalk XT, השתמש במערכת CatWalk ובתוכנה המתאימה (מחשב, תוכנה עם רישיון) (איור 2A). בצע את הניסוי בתנאים כהים, מכיוון שרכישת נתונים תלויה בתאורה של שביל ההליכה של מערכת CatWalk עם נורית LED ירוקה. כדי להקל על ההליך הניסיוני בתנאים כהים, להאיר את חדר הניסוי עם אור אדום. השתמש במסלול הליכה מוגדר שאורכו 65 ס”מ ורוחבו 7 ס”מ; עם זאת, גודל שביל ההליכה תלוי בגודל החולדות. הגדר את שביל ההליכה גדול ככל האפשר כדי לתעד עקבות רבות ככל האפשר עבור כל כפה. לכוד מספר מינימלי של שלוש עקבות לכל כף רגל עבור כל ריצה. בעת הגדרת אורך שביל ההליכה, שקול את גופו וזנבו של החולדה, שכן ייתכן שאות ההתחלה או העצירה לא יזוהה כראוי וייתכן שהריצה לא תסווג כתואמת, אם הגוף /הזנב נכנס או נשאר על שביל ההליכה המוגדר לפני או אחרי השלמת הריצה. הדרכההערה: הכשרת החולדות למערכת CatWalk נחוצה כדי להרגיל את בעלי החיים למערך ולאפשר להם ללמוד לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה. הכשרה נכונה מספקת את היתרונות של חיסכון בזמן במהלך הערכה ניסיונית והשגת תוצאות טובות יותר. הפעלת רכישת הנתונים של מערכת CatWalk במהלך אימונים מאפשרת לחולדות להתרגל לתנאי ההערכה (רעש /אור).התחל להגדיר את מערכת המסלול. נקו את שביל הזכוכית במים מזוקקים ובמטלית רכה ללא מוך. בהתחלה ובסוף הניסוי, או בין אם שביל הזכוכית מלוכלך, השתמשו בנוזל ניקוי זכוכית ובבד רך ללא מוך כדי לנקות את שביל הזכוכית. לאחר השימוש בנוזל ניקוי זכוכית, לנקות את השביל מכל שאריות של הנוזל, כדי למנוע את זה מסיח את דעתו של החיה. בחר את ההגדרות הניסיוניות. פרמטר חשוב הוא הפעל קריטריונים. הגדר ערכים מתאימים עבור משך הפעלה מינימלי, משך הפעלה מרביומספר מינימלי של הפעלות תואמות לרכישה, הספציפיות עבור כל פרוייקט מחקר. סמן את התיבה השתמש בווריאציה המרבית המותרת במהירות והגדר את הערך. ניתן להתעלם מקריטריוני הריצה בארבעה עד חמישה ימי האימון הראשונים. מקם את המצלמה במיקום והתאם את המוקד. מצא את מיקום המצלמה האופטימלי כדי להשיג אורך מתאים של שביל ההליכה ואת הרזולוציה הטובה ביותר של כפות הכפות המוקלטות בו זמנית. סמן את מיקום המצלמה במערכת CatWalk כדי להבטיח מיקום מצלמה זהה בין ההקלטות. הגדר את הגדרות הזיהוי באמצעות הזיהוי האוטומטי עבור ניסוי חדש. ודא כי כל העקבות ניתן לזהות עם רעש רקע מינימלי . במידת הצורך, מטב את הגדרות הזיהוי באופן ידני ושנה את סף העוצמה הירוקה. השתמש באותן הגדרות זיהוי עבור הניסוי כולו. הקם את קירות המסדרון של מערכת המסלול. קירות המסדרון צריכים להיות קרובים ככל האפשר לחולדה. ודא שקירות המסדרון נשארים מקבילים לשביל ההליכה. הגדרת אורך שביל ההליכה: לחץ/י על הסמל ‘הגדר שביל’. התאם את גודל המלבן הלבן באורך וברוחב, בהתאם לפרויקט המחקר הספציפי. לחץ על אישור. כייל את שביל ההליכה: לחץ על סמל כיול שביל. מקם גיליון כיול מלבני בגודל 20×10 ס”מ באמצע שביל ההליכה. התאם את גודל המלבן הלבן לגליון הכיול. לחץ על אישור. לאחר מכן, הצמד תמונת רקע: ודא מראש שהשביל נקי וריק. לחץ על לחצן הצמד רקע כדי ליצור תמונת רקע. לאמן בעלי חיים לפחות שמונה ימים לפני תחילת הניסוי בפועל. מומלץ להתאמן בימים רצופים. יום 1 של אימונים: עבור חולדות להתרגל למערכת CatWalk, לאפשר לבעל החיים לחקור בחופשיות את שביל ההליכה ואת תיבת המטרה. תן לחולדות להתאמן בחציית שביל ההליכה והזן את תיבת המטרה. להרים את החולדה בסוף השביל או בתיבת המטרה ולהחזיר את החולדה לנקודת ההתחלה של שביל ההליכה. חמש ריצות מומלצות ליום הראשון של האימונים ללא צורך בעמידה בהגדרות הניסוי. יום 2 של אימונים: חולדות יכול לחקור בחופשיות את שביל ההליכה ואת תיבת המטרה. חמש ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי. יום 3 של אימונים: שמונה ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי. יום 4 של אימון: עשר ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי. יום 5 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש לזכור את הגדרות הניסוי. להניע את החולדות לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה. יום 6 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש לזכור את הגדרות הניסוי. להניע את החולדות לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה. יום 7 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש להשיג מינימום של שלוש ריצות תואמות. הוסף ריצות נוספות לבעלי חיים, אם הם לא הצליחו להגיע למטרה זו. יום 8 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש להשיג מינימום של שלוש ריצות תואמות. הוסף ריצות נוספות לבעלי חיים, אם הם לא הצליחו להגיע למטרה זו. הערכה בהתאם לקריטריוני ההפעלה המוגדרים, בצע שלוש ריצות תואמות לכל עכברוש לצורך ניתוח נתונים. להערכה, אנא בצעו את שלבים 3.2.1. – 3.2.1.8. כמתואר בסעיף האימונים. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלושת הריצות הראשונות, בצע מינימום של שש ריצות לכל מפגש / בשבוע למטרות אימון. בצע לפחות מפגש אחד (אימון) עם שש ריצות בשבוע עבור תבנית הליכה יציבה לניסויים עם נקודות זמן מרובות. הגדרות הניסוי והזיהוי נשארות עקביות עבור הניסוי כולו. ניתוח נתונים עבור ניתוח נתונים, הערך רק את הריצות התואמות. מחק ריצות שאינן תואמות. אמתו את סף העוצמה הירוקה והגדילו או הפחיתו את סף העוצמה הירוקה לפני סיווג הכף אם יש צורך בכך. סף העוצמה הירוקה חייב להיות עקבי עבור כל בעלי החיים וכל הריצות. סיווג הדפסות כפות רגליים באופן אוטומטי באמצעות תוכנת CatWalk XT (איור 2B). סקור תוויות הדפסת כפות רגליים באופן ידני. תקן תוויות הדפסה שגויות של כפות רגליים, הוסף תוויות של הדפסות כפות רגליים שלא זוהו ומחק רעש ותוויות שגויות באופן ידני. העבר את הווידאו למיקום, שיש לסקור באופן ידני. לתיקון הדפסות כפות רגליים עם תווית שגויה, בחר את המלבן של הדפסת הכפות הספציפית, לחץ על איפוס, בחר שוב באותו מלבן והקצה את התווית הנכונה מהרשימה. לתיוג הדפסות כפות רגליים שאינן מזוהות, צייר מלבן סביב הכף שאינה מזוהה, לחץ על הוסף הדפסה, בחר את המלבן החדש שנוצר והקצה את התווית הנכונה מהרשימה. במקרה שהתוכנה הנקראת אף או גוף מדפיסה באופן אוטומטי, בחר את המלבן של התווית הספציפית ולחץ על הסר הדפסה. סקור את התוצאות המספריות. התוצאות המספריות מוצגות בגיליון Excel ומציגות מספר פרמטרים בסיסיים. בחרו פרמטרים ספציפיים מוגדרים מראש, בהתאם לעניין המחקרי ובצעו ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 2D). לקבלת מידע מפורט יותר על כל טביעת רגל, לסווג את בהונות הכפות האחוריות. ניתוח זה דורש מודול מדידות טביעת רגל אינטראקטיבית. התאימו את סף העוצמה הירוקה לניתוח מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית במידת הצורך. סף העוצמה הירוקה חייב להיות עקבי עבור כל בעלי החיים וכל הריצות. הגדר את הסמנים לניתוח טביעת הרגל באופן ידני. לנתח כל טביעת כפה אחורית בכל שלוש הריצות התואמות. צייר קו ממרכז בוהן הראשונה למרכז בוהן החמישית כדי למדוד “התפשטות בוהן”. צייר קו ממרכז בוהן שנייה למרכז בוהן הרביעית כדי למדוד “התפשטות בוהן ביניים”. צייר קו ממרכז הבהונות השלישית לעקב הכף האחורית כדי למדוד “אורך הדפסה ידני”(איור 2C). סקור את התוצאות המספריות של “מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית” המוצגות בגיליון נפרד. בחר פרמטרים ספציפיים של “מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית” ובצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 2E). 4. משימת הליכה קרן הערה: גירעונות הליכה ניתן לקבוע על ידי משימת הליכה קרן. המוקד של משימת ההליכה קרן בנושא מחקר ספציפי זה יהיה ניתוח של תיאום מוטורי, המוגדר כיכולת לתאם הפעלת שרירים מחלקי גוף מרובים, ולא הערכה של איזון מוטורי, המוגדר כיכולת לשליטה יציבה במהלך תנועות הגוף. ההתקנה למשימת ההליכה של הקרן, השתמשו בקרן, במרווח, בטבלה, ברקע אחיד ובמצלמת וידאו(איור 3A). השתמשו בקורת עץ באורך 90 ס”מ, ברוחב 1.7 ס”מ ובגובה 2 ס”מ. מומלץ פלטפורמה באורך 20.5 ס”מ, רוחב 15 ס”מ וגובה 2 ס”מ בשני קצות הקרן. השתמש באותו חומר עבור הפלטפורמות ואת הקרן, למנוע כל מחסומים בין הפלטפורמות לבין הקרן. יש את המרחק בין הקרן לשולחן להיות לפחות 44 ס”מ. סביבה מוכרת כגון כלוב ביתי מניעה את החולדות לחצות את הקרן, אשר ניתן להציב בסוף פלטפורמת הקרן. הדרכה הניחו את הקרן עם מרווח וכלוב ביתי על השולחן. לאמן חיות במשך שבעה ימים. מומלץ להתאמן בימים רצופים. יום 1 של אימונים מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על פלטפורמת ההתחלה של הקרן. תן לחולדות לחקור את הסביבה (פלטפורמה / קרן). החזק חולדה אחת בזהירות על ידי הזנב ולהוביל את החולדה אל הקרן על ידי דחיפת החולדה בעדינות על הקרן. לסייע לחולדה לחצות את הקרן על ידי החזקת החולדה בזנבה לפחות שתי ריצות. תן לחולדה לחצות את הקרן לעוד שלוש ריצות ללא עזרה. שימו לב לחולדה וספקו סיוע במידת הצורך. אם החולדה לא מצליחה לחצות את הקרן, ליירט את הנפילה על מנת למנוע פציעות ופיתוח של פחד לחצות את הקרן. המשך עם הליך זה עבור כל החולדות.הערה: לפעמים חולדות עוקבות זו אחר זו כדי לחצות את הקרן, ובמקרה זה אין צורך בסיוע. עם זאת, חשוב להתבונן בחולדות, ליירט נופל ולספק סיוע במידת הצורך. יום 2 של אימונים מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על פלטפורמת ההתחלה של הקרן. תן לחולדות לחצות את הקרן שש פעמים. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל. יום 3 של אימונים מניחים חולדה אחת על פלטפורמת ההתחלה של הקרן. תן לחולדה לחצות את הקרן שש פעמים. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל. יום 4-7 של אימונים מניחים חולדה אחת על פלטפורמת ההתחלה של הקרן. תן לחולדה לחצות את הקרן עשר פעמים. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל. בסוף האימון, החולדה צריכה לחצות את הקרן ללא כל הפרעה לפחות שלוש ריצות. מותר לדחוף בעדינות את החולדה על פלטפורמת ההתחלה כדי לעורר ייזום של תנועה. הערכה הניחו את הקרן עם מרווח וכלוב ביתי על השולחן. מניחים את מצלמת הווידאו בעמדה, מיושר במקביל לקורה עם החיה בפוקוס. המיקום של מצלמת וידאו צריך להיות קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של התנועות המוקלטות. הקרן וחלקים משתי הפלטפורמות צריכים להיתפס על ידי ההקלטה. התחל את ההקלטה וזהה תחילה את הפגישה ואת החיה. מניחים את החולדה על פלטפורמת ההתחלה של הקרן. החולדה צריכה לחצות את הקרן שלוש פעמים ללא כל הפרעה. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלושת הריצות הראשונות, בצע מינימום של שש עד עשר ריצות לביצועי משימה רציפים. תמיד, להתבונן החיה וליירט נופל, במידת הצורך. לאחר המשימה, לנקות את הקרן ואת השולחן עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר.הערה: בשבועיים הראשונים לאחר פציעת ריסוק עצבי, החולדות אינן מסוגלות לחצות את הקרן ללא סיוע. לכן, סיוע צריך להינתן עבור שש עד שמונה ריצות בשבועיים הראשונים לאחר פציעת מעיכה עצבית. משבוע שלישי לשבוע החמישי מבוצעות חמש ריצות בסיוע ועשר ריצות נוספות בוצעו ללא סיוע. ניתוח נתונים השתמש בתוכנת ניתוח וידאו חינם Kinovea לניתוח נתונים. בחר את רצפי הווידאו של שלוש ריצות תואמות מההקלטה. לצורך כך, בחר את שלושת הריצות הראשונות שבוצעו ללא סיוע של החיה. היה עקבי בבחירת ההפעלה התואמת עבור כל החולדות. הגדר את נקודת שעת ההתחלה ואת נקודת שעת הסיום של שלוש הריצות התואמות שנבחרו (איור 3D-E). בהגדרה זו, נקודת ההתחלה תויגה על ידי קו שחור על הקרן ואת המיקום של hindlimb הראשון מאחורי הקו השחור הגדיר את נקודת זמן ההתחלה של הריצה. המיקום של hindlimb הראשון על הפלטפורמה בסוף הקרן מגדיר את נקודת זמן הסיום. לאחר מכן, לחשב את הזמן הדרוש לחולדה לחצות את הקרן. דווח על נתונים כזמן השהיה כדי לחצות את הקרן בשניות ולבצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 3B). ניקוד מספר השלבים והשגיאות משלוש ריצות תואמות עבור שני hindlimbs בנפרד באמצעות זום ופונקציה בהילוך איטי של התוכנה. השגיאות כוללות סה”כ החלקות רגל וגלישות של חצי רגל. החלקת רגל כוללת מוגדרת כמיקום רגל ואחריו החלקה עמוקה הגורמת לאובדן מגע של הכף המושפעת עם הקרן (איור 3F). חצי החלקה מוגדרת ככף רגל המחליקה מהקירות הצדדיות של הקרן מבלי לאבד מגע מלא עם הקרן (איור 3G). לחשב את אחוז החלקות רגל ביחס למספר הצעדים לחצות את הקרן ((מספר החלקות רגל של האיבר x 100%)/ מספר צעדים של אותו איבר). הצג נתונים כאחוזים מחליקים ובצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 3C). 5. משימת הליכה סולם צלצל הערה: משימת ההליכה של דרגת הסולם יכולה להעריך את התפקוד המוטורי, את המיקום של שני החלק הקדמי וההינדסים, ואת קואורדינציית interlimb. ההתקנה השתמש במנגנון סולם, מרווח, שולחן, רקע אחיד ומצלמת וידאו לבדיקה התנהגותית זו (איור 4A). מנגנון שלב הסולם האופקי מורכב שלבים מתכת ו קירות צדדיים פוליקרבונט ברור. אורכו של המנגנון 119.5 ס”מ והרוחב מותאם ל-7.4 ס”מ. אורך שביל ההליכה שיש לנתח הוא 100 ס”מ. סמן את נקודת ההתחלה והסיום עם קו שחור בצד. מקם מצייני מיקום עבור שלבים במנגנון במרווחים של 1 ס”מ. מסדרים תבנית לא סדירה של שלבים עבור שביל 100 ס”מ עם מרחק בין 1 ל 5 ס”מ בין שלבים. הראשון 10 ס”מ בהתחלה האחרון 9.5 ס”מ בסוף המנגנון, אשר אינם נכללים בניתוח, יש דפוס קבוע של שלבים עם מרחק של 1 ס”מ. יש להשתמש במרחק בין שביל ההליכה לשולחן של כ-30 ס”מ(איור 4A-B). קופסת מטרה או סביבה מוכרת בסוף המנגנון, כמו כלוב ביתי, מניעה את החולדות לחצות את מנגנון דרגת הסולם. הדרכה הגדר את מנגנון צלצל הסולם עם מרווח ותיבת מטרה על השולחן. לאמן חיות במשך שמונה ימים. מומלץ להתאמן בימים רצופים. יום 1 של אימונים מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על מנגנון דרגת הסולם. תן לחולדות לחקור את הסביבה (מנגנון צלצל סולם / תיבת מטרה). בעדינות לדחוף את החולדות לכיוון תיבת המטרה. לסייע לחולדות בהזנת תיבת המטרה. תן לחולדות לחקור את תיבת המטרה לזמן מה. אחרי שכל החולדות נכנסו לתיבת השער. קח את החולדה הראשונה מתיבת המטרה והנח את החולדה על אזור ההתחלה של המנגנון שוב. המשך עם אותו הליך עבור כל החולדות של כלוב בית אחד. בעדינות לדחוף את החולדות לכיוון תיבת המטרה ולתת סיוע להיכנס לתיבת המטרה, במידת הצורך. תן לחולדה לחצות את המנגנון ארבע פעמים. יום 2 של אימונים בצע את אותו פרוטוקול כמפורט ליום הראשון של האימון. תן לחולדה לחצות את המנגנון שש פעמים. יום 3 של אימונים בצע את אותו פרוטוקול כמפורט ליום הראשון של האימון. תן לחולדה לחצות את המנגנון שמונה פעמים. יום 4 של אימונים מניחים חולדה אחת על תחילת מנגנון דרגת הסולם. אם החולדה אינה חוצה את המנגנון ונכנסת לתיבת המטרה בהתנדבות, תן סיוע על ידי דחיפת החולדה בעדינות מאחור. תן לחולדה לחצות את המנגנון שמונה פעמים. יום 5-8 של אימונים מניחים חולדה אחת על תחילת מנגנון דרגת הסולם. אם החולדה אינה חוצה את המנגנון ונכנסת לתיבת המטרה בהתנדבות, תן סיוע על ידי דחיפת החולדה בעדינות מאחור. תן לחולדה לחצות את המנגנון עשר פעמים. בסוף האימון, החולדה אמורה להיות מסוגלת לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה וסיוע למינימום של שלוש ריצות. מותר לתת לחולדה דחיפה עדינה באזור ההתחלה כדי לעורר ייזום תנועה. הערכה הגדר את מנגנון צלצל הסולם עם מרווח ותיבת מטרה על השולחן. מניחים את מצלמת הווידאו בעמדה, מיושר במקביל למנגנון עם החיה בפוקוס. מקם את מצלמת הווידאו קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של התנועות המוקלטות ולהבטיח כי מנגנון סולם שלם נתפס בהקלטה. התחל את ההקלטה וזהה תחילה את הפגישה ואת החיה. מניחים את החולדה על אזור ההתחלה של מנגנון צלצל הסולם. החולדה צריכה לחצות את שביל 100 ס”מ של מנגנון שלב הסולם שלוש פעמים ללא כל הפרעה על מנת שזה יהיה זכאי כמו ריצה תואמת. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלוש הריצות הראשונות, יש לבצע לפחות עשר ריצות לביצועי משימה רציפים. לאחר המשימה, לנקות את המנגנון ואת השולחן עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר. ניתוח נתונים השתמש בתוכנת ניתוח וידאו חינם Kinovea לניתוח נתונים. בחר את רצפי הווידאו של שלוש ריצות תואמות מההקלטה. בחר את שלוש הריצות הראשונות התואמות לניתוח נתונים. הגדר את נקודת שעת ההתחלה ואת נקודת שעת הסיום של שלוש הריצות התואמות שנבחרו. המיקום של hindlimb הראשון מאחורי הקו השחור הראשון על הצד של המנגנון, אשר מתייג את נקודת זמן ההתחלה של שביל 100 ס”מ, מגדיר את נקודת זמן ההתחלה של הריצה. המיקום של החזית הראשונה מאחורי הקו השחור השני על הצד של המנגנון, אשר מתייג את נקודת הסיום של שביל 100 ס”מ, מגדיר את נקודת זמן הסיום של הריצה. זהה את נקודת שעת ההתחלה והסיום. לאחר מכן, חשב את משך הריצה לאורך שביל ההליכה. דווח על נתונים כזמן השהיה כדי לחצות את שביל ההליכה בשניות ולבצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 4C). ניקוד שלוש ריצות תואמות עם סולם 7 קטגוריות מ Metz ואח ‘באמצעות ההילוך האיטי או פונקציית מסגרת אחר מסגרת של התוכנה (איור 5)16,17. קבע את מספר השלבים ואת מספר השגיאות בהתאם לקטגוריות הסולם עבור כל איבר בנפרד. קנה המידה מבחין בין הקטגוריות הבאות: (0) החטאה כוללת (1) החלקה עמוקה (2) החלקה קלה (3) החלפה (4) תיקון (5) מיקום חלקי, ו-(6) מיקום נכון. רק השגיאה של האיבר היוזם דורגה. שגיאות נוספות, המופעלות על-ידי השגיאה הראשונית, אינן צריכות להיות מדורגות. חשב את השגיאות/שלב על-ידי התחשבות בדרישות הבאות. הקטגוריות (0) החטאה כוללת (1) החלקה עמוקה (2) ספירה קלה של החלקה כשגיאה. חלק את מספר השגיאות במספר השלבים עבור כל hindlimb וכל הפעלה בנפרד. קבעו את הערך הממוצע של כל שלוש הריצות התואמות לכל בעל חיים ולכל אחת מהן בנפרד ובצעו ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 4D).