Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Erklärung zur TierethikDiese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt. Die Protokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der University of California genehmigt (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01). 1. Überflutungsversuche an Nicht-Gene-Drive-Mücken (Abbildung 1) Aufbau und Wartung des Käfigs Richten Sie drei Sätze von dreifachen 0,216 m3 Käfigen ein, indem Sie in jedem Käfig über drei aufeinanderfolgende Wochen 60 Wildtyplarven (WT) im zweiten Stadium hinzufügen.HINWEIS: Es ist nicht möglich, das Geschlecht von Larven im zweiten Stadium durch Lichtmikroskopie zu bestimmen, so dass die Proben, die jedem Käfig hinzugefügt werden, sowohl aus Männchen als auch aus Weibchen bestehen. Stellen Sie den erwachsenen Weibchen in jedem Käfig jede Woche betäubte Mäuse als Blutmehlquelle (Abbildung 2A) und 3 Tage nach dem Blutmehl einen Eiablagebehälter zur Verfügung.HINWEIS: Während ein alternatives künstliches Fütterungsgerät verwendet werden kann, führt die Bereitstellung von lebenden betäubten Mäusen für Blutmehl zu einer besseren Mückenfütterungsleistung in diesen großen (0,216 m3) Käfigformaten. Dies erfordert ein genehmigtes Tierverwendungsprotokoll und eine entsprechende Genehmigung (z. B. Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) für die Verwendung von Mäusen.HINWEIS: Einzelne Mäuse werden mit einer Mischung aus 4 mg/Mausketamin HCl und 0,4 mg/Maus-Xylazin betäubt. Den Tieren werden zwischen 0,1 und 0,5 ml dieser Mischung injiziert. Brüten Sie wöchentlich Eier aus jedem Käfig aus und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 60 Larven im zweiten Stadium (L2) aus, die in ihre jeweiligen Käfige zurückgebracht werden, um die Mortalität auszugleichen (Wochen 4-8).ANMERKUNG: Die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 sind notwendig, um eine stabile und verteilte altersstrukturierte Population in den Käfigen zu etablieren – die als “Anfangsphase” bezeichnet wird. Weisen Sie in Woche 9 die in Schritt 1.1.1 zufällig zusammengesetzten Käfige in Triplikaten zu, um das gewünschte männliche Freisetzungsverhältnis freizusetzen. Legen Sie einen Satz dreifacher Käfige als Kontrollen fest, um die Konsistenz während des gesamten Experiments zu bewerten. Legen Sie einen Satz Triplikate für jedes gewünschte Freisetzungsverhältnis fest (z. B. 1:1 oder 1:0,1 transgene:WT-Männchen).HINWEIS: Dieser Punkt wird als “experimentelle Phase” bezeichnet. Replikations- und Release-Verhältnisse Wöchentlich 60 WT-Puppen (30 Männchen und 30 Weibchen) in die Kontrollkäfige geben. Um ein Verhältnis von 1: 1 aufrechtzuerhalten, fügen Sie wöchentlich 30 transgene männliche Puppen zusammen mit 60 (30 männlichen und 30 weiblichen) WT-Puppen in den jeweiligen Käfig hinzu. Um ein Verhältnis von 1:0,1 aufrechtzuerhalten, fügen Sie wöchentlich 300 transgene männliche Puppen zusammen mit 60 (30 männlichen und 30 weiblichen) WT-Puppen in den jeweiligen Käfig hinzu.HINWEIS: Die fortgesetzte Zugabe von wilden Moskitos zu den Käfigen hält die Käfigdichte aufrecht, die aufgrund der altersbedingten Erwachsenensterblichkeit voraussichtlich wöchentlich abnehmen wird. Screening von Phänotypen Wählen Sie insgesamt 300 Larven aus jedem Käfig nach dem Zufallsprinzip aus. Mit der Verwendung eines Stereomikroskops, das mit Fluoreszenzfiltern ausgestattet ist, wird die Expression des fluoreszierenden dominanten Markers im Larven- und Puppenstadium untersucht und das Geschlecht der resultierenden Erwachsenen bewertet (Abbildung 3).HINWEIS: Das phänotypische Screening hängt von dem dominanten Marker ab, der im transgenen Konstrukt enthalten ist, das in die Moskitos integriert ist (z. B. Discosoma sp. rot fluoreszierendes Protein [DsRed], cyanfarbenes fluoreszierendes Protein [CFP], grün fluoreszierendes Protein [GFP]), und vom Promotor, der seine Expression antreibt (der am häufigsten verwendete in der Mückentransgenese verwendet wird, ist der 3xP3-Promotor, der die Expression in den Augen und der Nervenschleimhaut antreibt). Befolgen Sie dieses Protokoll für so viele Generationen, wie es die im Versuchsdesign definierten Ergebnisparameter erfordern.HINWEIS: Die Studie wird normalerweise beendet, wenn alle Moskitos mindestens eine Kopie des Transgens haben (bestimmt durch das Vorhandensein des dominanten fluoreszierenden Markers) oder das Verhältnis von transgenen zu WT-Mücken in einem Käfig stabilisiert ist und nach einigen (3-5) Generationen nicht stark schwankt. 2. Überlappende Generationsversuche von Gene-Drive-Mücken (Abbildung 4) HINWEIS: Moskitos, die Gene-Drive-Systeme tragen, erfordern schriftliche und überprüfte Protokolle und sollten von einem Institutional Biosafety Committee (IBC) oder gleichwertig und anderen, falls erforderlich, genehmigt werden. Die Eindämmung von Mücken (ACL 2+ Level) sollte den empfohlenen Verfahren folgen5,6,7. Insbesondere sollten die Gene-Drive-Experimente zwei strenge Einschlussstrategien anwenden. Die erste sind in der Regel physische Barrieren (Barrierestrategie) zwischen Organismen und der Umwelt. Dies erfordert ein sicheres Insektarium und Standardarbeitsanweisungen (einschließlich Überwachung), um sicherzustellen, dass Moskitos nicht entkommen können. Die zweite Einschlussstrategie kann molekular, ökologisch oder reproduktiv sein5. Käfig-Setup Richten Sie zwei Sätze von dreifachen 0,216 m3 Käfigen für jedes gewünschte transgene: WT-Freisetzungsverhältnis für Männer ein. Um ein männliches Freisetzungsverhältnis von 1:1 zu erreichen, fügen Sie 120 transgene Männchen, 120 WT-Männchen und 120 WT-Weibchen im Puppenstadium zu jedem Replikatkäfig hinzu. Um ein Freisetzungsverhältnis von 1:10 zu erreichen, fügen Sie 12 transgene Männchen, 120 WT-Männchen und 120 WT-Weibchen im Puppenstadium zu jedem Replikationskäfig hinzu.HINWEIS: Verschiedene Freisetzungsverhältnisse können getestet werden (1: 1, 1: 3, 1: 10 usw.) und die Anzahl der Moskitos, die zur Einleitung der Experimente verwendet werden, variiert entsprechend. Es ist jedoch wichtig, die Auswirkungen niedriger Zahlen auf die statistische Auswertung der Daten zu berücksichtigen. Populationserhaltung und Screening Versorgen Sie 4-7 Tage alte Weibchen in jedem Käfig mit einer Blutmahlzeit mit anästhesierten Mäusen (Abbildung 2A). Legen Sie drei Tage nach der Blutmahlzeit einen Eiablagebehälter in jeden Käfig. Bruten Sie Eier in einer Larvenschale, wählen Sie ~ 240 Larven des ersten Stadiums (L1) nach dem Zufallsprinzip aus jedem Käfig aus, ziehen Sie sie bis ins Erwachsenenalter auf und bringen Sie sie in ihre jeweiligen Käfige zurück. Geben Sie zusätzliche (2-3) Blutmahlzeiten alle 3-4 Tage für die neu aufgetauchten Erwachsenen, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben.HINWEIS: Während der nachfolgenden Generationen werden keine zusätzlichen transgenen Männchen hinzugefügt. Wählen Sie insgesamt 300 Larven aus jedem Käfig nach dem Zufallsprinzip aus und screenen Sie sie mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf das Vorhandensein des dominanten Marker-Phänotyps im Larven- und Puppenstadium und bewerten Sie aufstrebende Erwachsene für das Geschlecht (Abbildung 3).HINWEIS: Wie bisher hängt das phänotypische Screening von dem dominanten Marker und Promotor ab, der im Gene-Drive-System enthalten und in die transgenen Moskitos integriert ist (z. B. DsRed, CFP oder GFP). Wenn homozygote oder heteroallelische Störungen der Zielgene zu einem sichtbaren Phänotyp führen (z. B. Gene, die mit der Augenpigmentierung zusammenhängen), hängt das Screening dieses Merkmals davon ab, in welchem Stadium es am einfachsten ist, den veränderten Phänotyp zu visualisieren. Befolgen Sie dieses Protokoll für so viele Generationen, wie es die im Versuchsdesign definierten Ergebnisparameter erfordern.HINWEIS: Jede Generation (abgegrenzt durch die Blutmahlzeit) dauert ~ drei Wochen. Die Studie wird normalerweise beendet, wenn alle Moskitos für das Gene-Drive-Konstrukt als homozygot gelten oder sich die Populationen bei einem maximalen Prozentsatz von Moskitos stabilisieren, die mindestens eine Kopie des Gene-Drive-Konstrukts tragen. 3. Nicht überlappende Generationsversuche mit Gene-Drive-Moskitos (Abbildung 5). Käfig-Setup Richten Sie dreifach 0,005 m3 Käfigpopulationen für jedes spezifische Freisetzungsverhältnis von transgenen zu WT-Männchen ein, die untersucht werden sollen (z. B. drei Sätze von dreifachen Käfigen mit einem Freisetzungsverhältnis von 1: 1, 1: 3, 1: 10). Richten Sie alle Käfige mit einer gleichen Gesamtzahl von Männchen und Weibchen ein.HINWEIS: Die Ergänzende Datei ist ein Video, das den Bau des 0,005 m3 großen Koloniekäfigs demonstriert. Fügen Sie 50 transgene Männchen, 50 WT-Männchen und 100 WT-Weibchen zu jedem der drei Replikationskäfige hinzu, um ein männliches Freisetzungsverhältnis von 1:1 zu erreichen. Fügen Sie 25 transgene Männchen, 75 WT-Männchen und 100 WT-Weibchen zu jedem der drei Replikationskäfige hinzu, um ein 1:3-Freisetzungsverhältnis von 1:3 zu erreichen. Fügen Sie 9 transgene Männchen, 90 WT-Männchen und 100 WT-Weibchen zu jedem der drei Replikationskäfige hinzu, um ein 1:10 männliches Freisetzungsverhältnis zu erreichen.HINWEIS: Verschiedene Freisetzungsverhältnisse können getestet werden und die Anzahl der Moskitos, die zur Einleitung der Experimente verwendet werden, kann entsprechend variieren. Es ist jedoch wichtig, die Auswirkungen einer geringen Anzahl von Moskitos auf die statistischen Analysen zu berücksichtigen. Dies sind Single-Veröffentlichungen; bei einer nachfolgenden Generation kommen keine zusätzlichen transgenen Männchen hinzu. Populationserhaltung und Screening Versorgen Sie die 4-7 Tage alten Weibchen in jedem Käfig an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit Blutmahlzeiten unter Verwendung eines künstlichen Fütterungsgeräts (Abbildung 2B).HINWEIS: Routinemäßige Blutmahlzeiten für Frauen bestehen aus einer kommerziell erhältlichen Blutquelle (z. B. Kälberblut), die aus einem Fütterungsgerät bereitgestellt wird. Lebende anästhesierte Mäuse werden nur verwendet, um Blutmehl in größeren (0,216 m3) Käfigformaten für eine bessere Fütterungsleistung bereitzustellen. Fügen Sie 3 Tage nach dem zweiten Blutmehl einen Eiablagebehälter hinzu. Entfernen Sie nach drei Tagen die Eiablagebehälter.HINWEIS: In diesem Schritt können 5-10 Weibchen nach dem Zufallsprinzip aus jedem Käfig ausgewählt und einzeln in Fläschchen gelegt werden, um bei Bedarf zusätzliche Fitnessparameter wie Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit zu beurteilen. Bewerten Sie nach Geschlecht alle Erwachsenen (tot und lebendig), die im Käfig verbleiben, und lagern Sie sie bei -80 ° C für molekulare Analysen. Schlüpfen Sie Eier und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 200 L1-Larven aus den Käfigen im Verhältnis 1: 1 und 1: 3 aus, um neue Käfige für die nächste Generation zu bevölkern.HINWEIS: Aufgrund der geringen Häufigkeit, mit der transgene Individuen in den Käfigen im Verhältnis 1:10 beginnen, kann eine Zufallsstichprobe zu einem übermäßigen Verlust transgener Nachkommen in der nächsten Generation führen, um die Population fortzusetzen. Um eine genaue Probenahme für die 1:10-Käfige und eine ausreichende Anzahl transgener Moskitos zu gewährleisten, sollten Sie alle Larven auf den dominanten Marker untersuchen und 200 Larven auswählen, die die beobachtete Transgenfrequenz widerspiegeln, um die neuen Käfige zu bevölkern.HINWEIS: Die 1:10-Käfige können identisch mit 1:1- und 1:3-Käfigen gehalten werden, wenn sie eine Transgenfrequenz von ≥80% erreichen. Wählen Sie 500 Larven aus jedem Käfig nach dem Zufallsprinzip aus, um eine eingehende Analyse durchzuführen. Screenen Sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die erwarteten Marker-Phänotypen im Larven- und Puppenstadium und das Score-Geschlecht von Erwachsenen (Abbildung 3).HINWEIS: “Außergewöhnliche” Phänotypen können ausgewählt werden, um weiter gekreuzt und molekular analysiert zu werden, um die Bildung resistenter Allele zu überwachen. Dieses Protokoll kann für so viele Generationen befolgt werden, wie es die im Versuchsdesign definierten Ergebnisparameter erfordern.HINWEIS: Jede Generation wird durch das Blutmehl begrenzt und dauert ~ drei Wochen. Die Studie wird normalerweise beendet, wenn alle Moskitos für das Gene-Drive-Konstrukt als homozygot gelten oder sich die Populationen bei einer maximalen Prävalenz transgener Moskitos stabilisieren. Und wie bisher hängt das Screening auf Phänotypen von den dominanten Markern und Promotoren ab, die in den transgenen Mücken (z. B. DsRed, CFP, GFP) oder in den Zielgenen integriert sind, wenn sie einen sichtbaren Phänotyp aufweisen (z. B. Gene, die mit der Augenpigmentierung zusammenhängen).