التجارب المختبرية للأقفاص الصغيرة للبعوض أنوفيلين المهندسة وراثيا

بيان أخلاقيات الحيوانوقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا (أرقام ضمان رعاية الحيوان A3416.01). 1. تجارب إطلاق الغمر على البعوض غير الجيني (الشكل 1) إعداد القفص وصيانته إعداد ثلاث مجموعات من ثلاثة أقفاص ثلاثية 0.216 M3 عن طريق إضافة 60 يرقات من النوع البري الثاني (WT) في كل قفص على مدى ثلاثة أسابيع متتالية.ملاحظة: لا يمكن تحديد جنس يرقات النجم الثاني عن طريق المجهر الخفيف ، لذلك ستتألف العينات المضافة إلى كل قفص من الذكور والإناث على حد سواء. في كل أسبوع، قم بتزويد الإناث البالغات في كل قفص بالفئران المخدرة كمصدر دقيق الدم (الشكل 2A) وحاوية oviposition بعد 3 أيام من دقيق الدم.ملاحظة: في حين يمكن استخدام جهاز تغذية اصطناعي بديل، فإن توفير فئران مخدرة حية لدقيق الدم يؤدي إلى أداء أفضل لتغذية البعوض في هذه الأشكال الكبيرة (0.216 m3) للأقفاص. وهذا يتطلب بروتوكول استخدام الحيوانات المعتمدة ذات الصلة (على سبيل المثال، اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه، IACUC) الموافقة على استخدام الفئران.ملاحظة: يتم تخدير الفئران الفردية مع خليط من 4 ملغ / الماوس الكيتامين HCl و 0.4 ملغ / الماوس xylazine. يتم حقن الحيوانات مع ما بين 0.1 – 0.5 مل من هذا الخليط. يفقس البيض من كل قفص أسبوعيا ويختار 60 يرقة ثانية (L2) عشوائيا ليتم إعادتها إلى أقفاصكل منها لتعويض الوفيات (الأسابيع 4-8).ملاحظة: الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3 ضرورية لإنشاء مجموعة سكانية مستقرة وموزعة من حيث العمر في الأقفاص – يشار إليها باسم “المرحلة الأولية”. في الأسبوع 9، تعيين أقفاص تجميعها في الخطوة 1.1.1 عشوائيا في ثلاث نسخ لإطلاق سراح نسبة الإفراج عن الذكور المطلوب. تعيين مجموعة واحدة من الأقفاص ثلاثية الليكات كضوابط لتقييم الاتساق طوال التجربة. تعيين مجموعة واحدة من ثلاثية لكل نسبة إطلاق مرغوبة (على سبيل المثال، 1:1 أو 1:0.1 من الذكور المعدلة وراثيا:WT).ملاحظة: يشار إلى هذه النقطة على “المرحلة التجريبية”. نسخ متماثلة ونسب الإصدار إضافة 60 WT pupae (30 الذكور و 30 الإناث) إلى أقفاص التحكم أسبوعيا. للحفاظ على نسبة 1:1، إضافة الأسبوعية 30 الخوادر الذكور المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع 60 (30 ذكرا و 30 أنثى) جروة WT في كل قفص كل منهما. للحفاظ على نسبة 1:0.1، إضافة أسبوعية 300 الخوخ الذكور المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع 60 (30 من الذكور و 30 أنثى) WT الخوخ في كل قفص كل منهما.ملاحظة: إن استمرار إضافة البعوض البري إلى الأقفاص يحافظ على كثافة الأقفاص، والتي من المتوقع أن تقل أسبوعيا بسبب وفيات البالغين المرتبطة بالعمر. فحص الأنماط الظاهرية اختر ما مجموعه 300 يرقة من كل قفص عشوائيا. مع استخدام مجهر ستيريو مجهزة مرشحات مضان، شاشة للتعبير عن علامة الفلورسنت المهيمنة في مراحل اليرقات والجراء ويسجل جنس البالغين الناتجة (الشكل 3).ملاحظة: سيعتمد الفحص الظاهري على العلامة المهيمنة المضمنة في بناء المتحولين جنسيا المدمجين في البعوض (على سبيل المثال ، Discosoma sp. بروتين الفلورسنت الأحمر [DsRed] ، بروتين الفلورسنت السماوي [CFP] ، البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) ، وعلى المروج الذي يقود تعبيره (الأكثر استخداما في تكوين البعوض هو تعبير قيادة المروج 3xP3 في العينين والحبل العصبي). اتبع هذا البروتوكول لأجيال عديدة كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.ملاحظة: عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما يكون لدى جميع البعوض نسخة واحدة على الأقل من المتحول (التي يحددها وجود علامة الفلورسنت المهيمنة) أو تستقر نسبة البعوض المعدل وراثيا إلى WT في القفص ولا تتقلب بشكل كبير بعد بضعة أجيال (3-5). 2. تداخل تجارب توليد البعوض الدافع للجينات (الشكل 4) ملاحظة: يتطلب البعوض الذي يحمل أنظمة محركات الجينات بروتوكولات مكتوبة ومراجعتها وينبغي أن توافق عليه لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) أو ما يعادلها، وغيرها عند الحاجة. يجب أن يتبع احتواء البعوض (مستوى ACL 2+ ) الإجراءات الموصى بها5,6,7. وعلى وجه التحديد، ينبغي أن تستخدم تجارب محركات الجينات استراتيجيتين صارمتين للحبس. الأول هو عادة الحواجز المادية (استراتيجية الحاجز) بين الكائنات الحية والبيئة. وهذا يتطلب وجود إجراءات تشغيلية حشرية ومعيارية آمنة (بما في ذلك الرصد) لضمان عدم هروب البعوض. ويمكن أن تكون استراتيجية الحبس الثانية جزيئية أو إيكولوجية أو إنجابية5. إعداد القفص إعداد مجموعتين من ثلاثة أقفاص 0.216 M3 ثلاثية لكل المعدلة وراثيا المطلوبة: WT نسبة إطلاق سراح الذكور. لتحقيق نسبة إطلاق الذكور من 1:1، إضافة 120 الذكور المعدلة وراثيا، 120 WT الذكور و 120 WT الإناث في مرحلة الخوادر إلى كل قفص تكرار. لتحقيق نسبة إطلاق 1:10 ، أضف 12 ذكرا معدلا وراثيا و120 ذكرا من WT و120 أنثى WT في مرحلة الخوادر إلى كل قفص متماثل.ملاحظة: يمكن اختبار نسب إطلاق مختلفة (1:1، 1:3، 1:10، إلخ) ويختلف عدد البعوض المستخدم لبدء التجارب وفقا لذلك. ومع ذلك، من المهم النظر في آثار انخفاض الأعداد على التقييم الإحصائي للبيانات. صيانة السكان وفحصهم توفير 4-7 أيام الإناث القديمة في كل قفص مع وجبة الدم باستخدام الفئران تخدير (الشكل 2A). بعد ثلاثة أيام من وجبة الدم، أدخل حاوية oviposition في كل قفص. يفقس البيض في صينية يرقة ، حدد ~ 240 يرقات النجم الأول (L1) عشوائيا من كل قفص ، وربيها إلى مرحلة البلوغ ، وإعادتها إلى أقفاصها الخاصة. توفير وجبات دم إضافية (2-3) كل 3-4 أيام للبالغين الناشئين حديثا كما هو موضح في الخطوة 2.2.1.ملاحظة: لا تضاف أي ذكور معدلة وراثيا إضافية خلال أي من الأجيال اللاحقة. اختر ما مجموعه 300 يرقة من كل قفص عشوائيا وفحصها للكشف عن وجود النمط الظاهري المهيمن للعلامات في مراحل اليرقات والجراء باستخدام مجهر ستيريو مضان وسجل البالغين الناشئين لممارسة الجنس (الشكل 3).ملاحظة: كما كان الحال من قبل، سيعتمد الفحص الظاهري على العلامة المهيمنة والمروج المدرجة في نظام محرك الجينات ودمجها في البعوض المعدل وراثيا (على سبيل المثال، DsRed أو CFP أو GFP). إذا أدت الاضطرابات المثلية أو الاضطرابات غير العضوية للجينات المستهدفة إلى نمط الظاهري المرئي (على سبيل المثال ، الجينات المتعلقة تصبغ العين) ، فإن فحص هذه السمة يعتمد على المرحلة التي يكون من الأسهل تصور النمط الظاهري المتغير. اتبع هذا البروتوكول لأجيال عديدة كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.ملاحظة: كل جيل (محدد بوجبة الدم) يستغرق ~ ثلاثة أسابيع. عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما تعتبر جميع البعوض متجانسة لبناء محرك الجينات أو تستقر المجموعات عند نسبة مئوية قصوى من البعوض الذي يحمل نسخة واحدة على الأقل من بناء محرك الجينات. 3- تجارب الجيل غير المتداخلة للبعوض الذي يدفع الجينات (الشكل 5). إعداد القفص إعداد مجموعات قفص ثلاثية 0.005 م3 لكل نسبة إطلاق محددة من المعدلات وراثيا إلى الذكور WT للتحقيق فيها (على سبيل المثال، ثلاث مجموعات من أقفاص ثلاثية الليكات كل إعداد مع 1:1، 1:3، 1:10 نسب الإصدار). إعداد جميع الأقفاص مع العدد الإجمالي المتساوي للذكور والإناث.ملاحظة: الملف التكميلي هو شريط فيديو يوضح بناء قفص مستعمرة 0.005 M3 . إضافة 50 من الذكور المعدلة وراثيا، 50 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة 1:1 إطلاق الذكور. إضافة 25 الذكور المعدلة وراثيا، 75 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة الإفراج 1:3 الذكور. إضافة 9 ذكور المعدلة وراثيا، 90 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة 1:10 إطلاق الذكور.ملاحظة: يمكن اختبار نسب إطلاق مختلفة ويمكن أن يختلف عدد البعوض المستخدم لبدء التجارب وفقا لذلك. ومع ذلك، من المهم النظر في تأثير انخفاض أعداد البعوض على التحليلات الإحصائية. هذه هي الإصدارات المفردة; لا تضاف أي ذكور معدلة وراثيا إضافية في أي جيل لاحق. صيانة السكان وفحصهم تزويد الإناث بعمر 4-7 أيام في كل قفص بوجبات الدم باستخدام جهاز تغذية اصطناعي (الشكل 2B) في يومين متتاليين.ملاحظة: تتكون وجبات الدم الروتينية للإناث من مصدر للدم متاح تجاريا (مثل دم العجل) مقدم من جهاز التغذية. تستخدم الفئران المخدرة الحية فقط لتوفير دقيق الدم في أشكال قفص أكبر (0.216 m3) لتحسين أداء التغذية. إضافة حاوية oviposition 3 أيام بعد دقيق الدم الثاني. بعد ثلاثة أيام، قم بإزالة حاويات oviposition.ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن اختيار 5-10 إناث عشوائيا من كل قفص ووضعها بشكل فردي في قوارير لتقييم معلمات اللياقة البدنية الإضافية، مثل الخصوبة والبراز، إذا لزم الأمر. يسجل حسب الجنس جميع البالغين (حيا ونافقا) المتبقية في القفص وتخزينها في -80 درجة مئوية للتحليل الجزيئي. يفقس البيض واختيار عشوائيا 200 L1 اليرقات من 1:1 و 1:3 نسبة أقفاص لملء أقفاص جديدة للجيل القادم.ملاحظة: نظرا لانخفاض وتيرة بدء الفرد المعدلة وراثيا في أقفاص نسبة 1:10، قد يؤدي أخذ العينات العشوائية إلى فقدان المفرط للذرية المعدلة وراثيا في الجيل القادم على الاستمرار في السكان. لضمان أخذ عينات دقيقة لأقفاص 1:10 وأعداد كافية من البعوض المعدل وراثيا ، قم بفحص جميع اليرقات للكشف عن العلامة المهيمنة واختر 200 يرقة تعكس تردد المتحولين الملحوظين لملء الأقفاص الجديدة.ملاحظة: يمكن الحفاظ على أقفاص 1:10 بشكل مطابق لأقفاص 1:1 و 1:3 عندما تصل إلى تردد متحول بنسبة ≥80٪. اختر 500 يرقة من كل قفص عشوائيا لإجراء تحليل متعمق. شاشة تحت مجهر ستيريو مضان للأنماط الظاهرية علامة المتوقع في مراحل اليرقات والجراء ويسجل الجنس من البالغين (الشكل 3).ملاحظة: يمكن اختيار الأنماط الظاهرية “الاستثنائية” ليتم عبورها وتحليلها بشكل جزيئي لرصد تكوين الأليل المقاوم. ويمكن اتباع هذا البروتوكول لعدة أجيال كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.ملاحظة: يتم تعيين كل جيل بواسطة دقيق الدم ويستغرق ~ ثلاثة أسابيع. عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما تعتبر جميع البعوض متجانسة لبناء محرك الجينات أو يستقر السكان عند أقصى انتشار للبعوض المعدل وراثيا. وكما كان الحال من قبل ، فإن فحص الأنماط الظاهرية يعتمد على العلامات المهيمنة والمروج المتكامل في البعوض المعدل وراثيا (على سبيل المثال ، DsRed ، CFP ، GFP) أو في الجينات المستهدفة إذا كانت تقدم نمطا ظاهرا مرئيا (على سبيل المثال ، الجينات المتعلقة بتصبغ العين).