Хирургия и обработка образцов для коррелятивной визуализации мышиного легочного клапана
Summary
Здесь мы описываем коррелятивный рабочий процесс для иссечения, герметизации, фиксации и визуализации мышиного легочного клапана для определения валовой конформации и локальных структур внеклеточного матрикса.
Abstract
Основные причины заболеваний, связанных с сердечным клапаном (HVD), неуловимы. Мышиные животные модели обеспечивают отличный инструмент для изучения HVD, однако хирургический и инструментальный опыт, необходимый для точной количественной оценки структуры и организации в нескольких масштабах длины, затмил его продвижение. Эта работа содержит подробное описание рассечения мыша, окрашивания блока, обработки образцов и корреляционных процедур визуализации для изображения сердечного клапана в различных масштабах длины. Гидростатическое трансклапанное давление использовалось для контроля временной гетерогенности путем химической фиксации конформации сердечного клапана. Микрокоммуническая томография (мкКТ) использовалась для подтверждения геометрии сердечного клапана и обеспечения ориентира для последующей обработки образцов, необходимой для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии лица (SBF-SEM). Были взяты и реконструированы последовательные SEM-изображения внеклеточного матрикса (ECM) с высоким разрешением, чтобы обеспечить локальное 3D-представление его организации. Затем методы визуализации μCT и SBF-SEM были коррелированы для преодоления пространственных вариаций в легочном клапане. Хотя представленная работа посвящена исключительно легочному клапану, эта методология может быть принята для описания иерархической организации в биологических системах и имеет решающее значение для структурной характеристики в нескольких масштабах длины.
Introduction
Легочный клапан (PV) служит для обеспечения однонаправленного кровотока между правым желудочком и легочной артерией. Пороки развития легочного клапана связаны с несколькими формами врожденных пороков сердца. В настоящее время лечение врожденного заболевания клапанов сердца (HVD) – это восстановление клапанов или замена клапанов, что может потребовать нескольких инвазивных операций в течение всей жизни пациента1. Широко признано, что функция сердечного клапана происходит от его структуры, часто называемой структурно-функциональным коррелятом. Более конкретно, геометрические и биомеханические свойства сердца диктуют его функцию. Механические свойства, в свою очередь, определяются составом и организацией ECM. Разрабатывая метод определения биомеханических свойств клапанов сердца мысей, трансгенные животные модели могут быть использованы для опроса о роли ECM на функции сердечного клапана и дисфункции2,3,4,5.
Модель мышиных животных уже давно считается стандартом для молекулярных исследований, потому что трансгенные модели более доступны у мышей по сравнению с другими видами. Мышиные трансгенные модели обеспечивают универсальную платформу для исследования заболеваний, связанных с сердечными клапанами6. Тем не менее, хирургический опыт и требования к инструментам для характеристики как геометрии, так и организации ECM были основным препятствием в продвижении исследований HVD. Хстологические данные в литературе дают картину содержания внеклеточного матрикса мышиного клапана сердца, но только в виде 2D-изображений, и не в состоянии описать его 3D-архитектуру7,8. Кроме того, сердечный клапан является как пространственно, так и временно неоднородным, что затрудняет выводы в экспериментах относительно организации ECM, если выборка и конформация не фиксированы. Обычные методы 3D-характеристики, такие как МРТ или 3D-эхокардиография, не обеспечивают разрешения, необходимого для разрешения компонентов ECM9,10.
Эта работа подробно описывает полностью коррелятивный рабочий процесс, где временная гетерогенность, обусловленная сердечным циклом, была устранена путем фиксации конформации мышиного PV с гидростатическим трансклапанным давлением. Пространственная гетерогенность контролировалась именно путем выборки интересующих областей и регистрации наборов данных из различных методов визуализации, в частности μCT и последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии, в разных масштабах длины. Этот метод разведки с помощью μCT для направления отбора проб вниз по течению был предложен ранее, но поскольку легочный клапан демонстрирует временные вариации, на хирургическом уровне11потребовался дополнительный уровень контроля.
Исследования in vivo, описывающие биомеханику клапанов сердца мыщ, редки и вместо этого полагаются на вычислительные модели при описании деформационного поведения. Крайне важно, чтобы локальные внеклеточные данные по шкале нанометровой длины были связаны с геометрией и расположением сердечного клапана. Это, в свою очередь, обеспечивает количественное, пространственно отображенное распределение механически способствующих белков ECM, которые могут быть использованы для усиления существующих биомеханических моделей клапанов сердца12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Удаление желудочков служит двум целям. Во-первых, подвергая сторону желудочка атмосферному давлению, тем самым нужно лишь прикладывать трансклапанное давление с артериальной стороны легочного клапана для закрытия, а во-вторых, обеспечивая стабильное основание для предотвращения скр?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается, в частности, грантами R01HL139796 и R01HL128847 для CKB и RO1DE028297 и CBET1608058 для DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
