Инъекции векторов AAV для оптогенетики в обезболенном и бодрствующем мозге нечеловеческих приматов
Summary
В настоящее время оптогенетика у нечеловеческих приматов требует инъекции вирусных векторов в мозг. Оптимальный метод инъекции должен быть надежным и, для многих применений, способным нацеливаться на отдельные участки произвольной глубины, которые легко и однозначно идентифицируются в посмертной гистологии. Представлен инъекционный метод с этими свойствами.
Abstract
Оптогенетические методы произвели революцию в исследованиях в области неврологии и готовы сделать то же самое для неврологической генной терапии. Клиническое использование оптогенетики, однако, требует, чтобы безопасность и эффективность были продемонстрированы на животных моделях, в идеале у нечеловеческих приматов (NHP), из-за их неврологического сходства с людьми. Количество векторов-кандидатов, которые потенциально полезны для нейробиологии и медицины, огромно, и никаких высокопроизводительных средств для проверки этих векторов пока не существует. Таким образом, существует потребность в методах, позволяющих сделать множественные пространственно и объемно точные инъекции вирусных векторов в мозг NHP, которые могут быть однозначно идентифицированы с помощью посмертной гистологии. Описанным здесь является такой способ. Инжекционные канюли изготовлены из связанных политетрафторэтиленовых и нержавеющих труб. Эти канюли являются автоклавируемыми, одноразовыми и имеют низкие минимальные объемы нагрузки, что делает их идеальными для инъекций дорогих, высококонцентрированных вирусных векторных растворов. Инертное минеральное масло, окрашенное в красный цвет, заполняет мертвое пространство и образует видимый мениск с векторным раствором, позволяя мгновенно и точно измерять скорость и объемы инъекций. Масло загружается в заднюю часть канюли, снижая риск совместной инъекции с вектором. Канюли могут быть загружены за 10 минут, а инъекции могут быть сделаны за 20 минут. Эта процедура хорошо подходит для инъекций бодрствующим или обезболенным животным. При использовании для доставки высококачественных вирусных векторов эта процедура может производить надежную экспрессию оптогенетических белков, что позволяет оптически контролировать нейронную активность и поведение в НХЛ.
Introduction
Оптогенетика у нечеловеческих приматов (NHP) обычно включает в себя инъекцию вирусного вектора непосредственно в мозг. Один класс векторов, который хорошо подходит для этого приложения, основан на аденоассоциированном вирусе (AAV). Эти векторы состоят из белкового капсида, окружающего одноцепочечный геном ДНК, который, в свою очередь, состоит из промотора, гена опсина и, необязательно, других белково-кодирующих и генно-регуляторных элементов. Достижения в области молекулярного клонирования облегчили манипулирование и сочетание этих компонентов для разработки новых векторов. Следовательно, коллекция векторов AAV, которая потенциально полезна для оптогенетики NHP, велика и быстро растет.
В настоящее время полезность вектора AAV для оптогенетики NHP требует тестирования in vivo. Этот факт является существенным препятствием на пути прогресса. Животные должны использоваться экономно, и тестирование нескольких векторов на одном животном требует, чтобы места инъекций были расположены разумно относительно нейронной архитектуры и хорошо разделены относительно распространения вируса. Точная гистологическая оценка требует, чтобы инъекции были пространственно и объемно точными. Метод инъекций, ранее использовавшийся для фокальной доставки фармакологических средств 1,2,3,4, был адаптирован и упрощен для совершения таких инъекций. Этот метод инъекции является недорогим, использует одноразовые, стерилизуемые компоненты, может использоваться у анестезируемых или бодрствующих обезьян и может быть использован для нацеливания на различные области мозга любой глубины. Следующий протокол описывает пошаговые процедуры изготовления одноразовых компонентов и инъекций в мозг NHP. Обсуждаются преимущества и недостатки методики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Достижения в области оптогенетики NHP создали потребность в точных, надежных методах внутричерепной инъекции. Преимущества метода, описанного в этом отчете, заключаются в том, что он недорог, использует стерилизуемые и одноразовые компоненты и обладает способностью нацеливаться на различные области мозга любой глубины. Он также позволяет контролировать скорость и объем впрыска в силу скорости, с которой можно управлять воздушным клапаном. Давление воздуха может быть увеличено временно, чтобы выбить засор, а затем быстро уменьшено, чтобы избежать последующего перенапрыска, который будет вызван устойчивым давлением. Одноразовые компоненты снижают риск перекрестного загрязнения между местами инъекций.
Критические шаги в этом протоколе инъекции включают в себя строительство высококачественных канюль, загрузку их без введения пузырьков и выбор мест инъекции, которые не слишком близко друг к другу. Инъекции ≥1 см друг от друга обычно трансдуцируют непересекающиеся области, но эта эвристика зависит от вирусного серотипа, титра, промотора, объема, мишени и метода обнаружения. Выбор мест инъекций, которые не связаны напрямую, позволяет избежать потенциальных путаниц, возникающих в результате незаконного оборота опсина вдоль аксонов, и склонности некоторых серотипов AAV к ретроградной трансдукции.
Метод может быть использован для введения NHP во время анестезии и в стереотаксической рамке (рисунок 3) или предупредительной и фиксированной головой (рисунок 4). Преимущество первого заключается в том, что он позволяет направлять инъекции в стереотаксических координатах, и он позволяет визуально подтвердить проникновение канюли через острую дуротомию (разрезание твердой мозговой оболочки у бодрствующей обезьяны через хроническую трепанацию черепа повышает риск заражения). Последний подход имеет преимущества в уменьшении количества операций по выживанию и, следовательно, стресса для животного, будучи совместимым с электрофизиологическими записями во время поведения и используя ту же координатную рамку и приборы, используемые для вставки оптических волокон для экспериментов после инъекций. Техника инъекций у бодрствующих обезьян может быть дополнительно улучшена путем инъекций через искусственную твердую мозговую оболочку 13,14,15. Это даст дополнительные преимущества прямой визуализации мест инъекций и флуоресценции тканей, что указывает на успешную трансдукцию.
Несколько других методов инъекции AAV были использованы в NHP. Недавно было разработано многоканальное инъекционное устройство для равномерной доставки векторов AAV в большие корковые области NHP16. Аналогичные результаты можно получить, используя конвекционно-усиленную доставку17,18. Эти методы направлены на максимизацию распространения трансдукции, что является важной целью, но отличается от пространственной точности, которую стремится достичь наш метод.
Другим альтернативным методом является введение векторов AAV через боросиликатную трубку, которая скошена до острого наконечника на одном конце и прикреплена к шприцу Гамильтона на другом 5,6. Этот метод имеет много общего с методом, описанным в данной статье. Вирусный вектор удерживается в длине трубки, пространство в трубке за вирусом заполняется окрашенным маслом, а поток вектора контролируется через движение мениска масляного вектора. Этот альтернативный метод требует меньшего оборудования и подготовки, но он требует втягивания масла в боросиликатную трубку через скошенный наконечник под отрицательным давлением и последующей загрузки вектора по тому же маршруту. Это неизбежно приводит к следам масла, доставляемого в мозг. Кроме того, по нашему опыту, боросиликатная трубка должна иметь диаметр ~ 350 мкм, чтобы проникать в твердую мозговую оболочку даже при скошенном состоянии и, следовательно, наносить большие механические повреждения, чем более тонкая металлическая канюля, описанная в этой статье (рисунок 2D). Трубка 30 G была использована, потому что ее критическая нагрузка на изгиб достаточно высока, чтобы опосредовать проникновение твердой мозговой оболочки, несмотря на длину 1-10 см, потому что она плотно прилегает к трубке из PTFE и потому что она редко становится затрудненной. Трубка 33 G засоряется и изгибается легче и ее труднее соединить с трубкой из PTFE. Трубка 36 G недостаточно жесткая, чтобы проникнуть в тяжелую оболочку NHP.
Другой альтернативный метод впрыска заключается в сопряжении выхода воздушного насоса с задней частью векторной стеклянной пипетки19. Вектор выталкивается из наконечника пипетки прямым, прерывистым давлением воздуха из насоса, устраняя необходимость в масле. Подобно однотрубному методу, описанному выше, отсутствие каких-либо материальных соединений между мениском и кончиком канюли снижает риск утечек. Однако острый конус и тонкие кончики стеклянных пипеток не позволяют им проникать в твердую мозговую оболочку NHP или нацеливаться на глубокие структуры.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), Национальным институтом здравоохранения (NIH) EY023277 (R01 для YK), EY030441 (R01 для GH), MH114126 (RF1 для JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 для JTT и GH), EY028902 (R01 для RS) и стало возможным благодаря грантам NIH OD010425 (P51 для WaNPRC) и Исследовательскому фонду A148416 Вашингтонского университета. Авторы хотели бы поблагодарить Ясмин Эль-Шамайле и Викторию Омстед за гистологию, Рефуджио Мартинеса за клонирование вирусных векторов и Джона Мича за помощь в обработке тканей мозга NHP.
Materials
| Equipment: Stereotaxic set | |||
| Item | |||
| Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
| Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
| Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
| Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
| Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
| Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
| Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
| Equipment: Cannula | |||
| Item | |||
| 1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
| Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
| Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
| Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
| Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
| Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
| P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
| PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
| Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
| Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
| Vector solution | (homemade) | NA | NA |
| Equipment: Electric air pump set | |||
| Item | |||
| Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
| Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
| Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
| Equipment: General surgery tools | |||
| Item | |||
| Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
| Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
| Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
| Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
| Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
| Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
| Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
| Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
| Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
| Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
| Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
| Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
| Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
| Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
| Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
| Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
| Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
| Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
| Suction | medela | 200-4869 | NA |
| Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
| Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
| Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
| Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
| Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
| Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
| Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
| Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
| Equipment: *cannulas | |||
| Item | |||
| Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
| Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
| PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
| Equipment: **colored oil | |||
| Item | |||
| Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
| Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
| STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma | |||
References
- Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades. Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).
- Kojima, Y., Soetedjo, R. Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades. Brain Research. 1366, 93-100 (2010).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation. Brain Research. 1401, 30-39 (2011).
- De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons. eLife. 9, 52658 (2020).
- El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum. Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).
- Mich, J. K., et al. Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex. Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).
- Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling. Neuron. (21), 00159 (2020).
- Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. Obstacle stepping in patients with Parkinson’s disease. Complexity does influence performance. Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).
- Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning. Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).
- Kleinbart, J. E., et al. A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).
- Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Fredericks, J. M., et al. Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neurosciences. 161 (2), 441-450 (2009).
