非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

すべての実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、実験動物資源研究所および実験動物管理国際評価認定協会が推奨する最小要件を超えました。すべての手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会(UW IACUCプロトコル#4167-01)によって評価および承認されました。5匹の健康なマカク(2匹のマカ カムラッタ、3匹の マカカネメストリナ、オス、4〜11歳)がこの研究に参加しました。滅菌器具と技術は、すべての外科手術を通して使用されました。 1.カニューレを作る(図1A) 各部の準備皮下注射針(30 G、長さ13 mm)の先端をディスクグラインダーで鈍らせます。 ステンレスチューブ(30G、内径=0.16mm、外径=0.31mm)を、対象の脳領域の深さに合わせた長さにカットします(大脳皮質の背側表面を注入するには25mmが適しています)。ディスクグラインダーを使用して、カットチューブの一方の端を面取りし、もう一方の端を滑らかにします。ブローチでチューブの内側をバリ取りします。 ポリテトラフルオロエチレン(PFTE)チューブ(内径= 0.23 mm±0.02 mm、壁= 0.23 mm±0.02 mm、1 mmは42 nL±7 nLの流体に相当)を、ロードするベクター溶液の量に適した長さにカットします(1 μLのベクター溶液がチューブの24 mmを占めます)。PTFEチューブの両端を鈍い皮下注射針の挿入によりフレアする。 鈍い皮下注射針をPTFEチューブの一端に約5mm挿入します。ステンレス鋼管の面取りされていない端をもう一方の端に約5 mm挿入します(図1A)。 インジェクション前のテストを実行します。カニューレの皮下注射針ハブを通してろ過水を注入します。斜めのステンレス鋼管から先端から水が出て、どちらの接合部からも水が漏れていないことを確認します。 2.麻酔をかけた動物のための注射手順 手術の準備材料表の手順を使用して手術器具および消耗品を滅菌します。 必要に応じて、脳深部構造を標的にするために頭部MRIを採取します(図2A)。 手術の直前に、ケタミン(10〜15 mg / kg)で動物を鎮静させ、抗生物質(セファゾリン)と鎮痛薬(徐放性ブプレノルフィンとメロキシカム)を筋肉内投与します。.次に、静脈内(IV)カテーテルを介して伏在静脈または頭静脈にプロポフォールを送達します。 動物を挿管し、イソフルランガスに移行する。安定した心拍数、血圧、呼吸数、骨格筋の弛緩、眼瞼反射や離脱反射がないことで、適切な麻酔を確認します。 動物の頭を剃ります。乾燥を防ぐために角膜に人工涙液軟膏を塗ります。 注入領域の準備動物の頭を脳定位固定装置フレームに入れます。ガーゼスポンジで剃った皮膚に外科的スクラブ溶液を塗布し、穏やかな圧力を加えて破片を取り除き、イソプロピルアルコールですすいでください。このプロセスを3回繰り返します。動物を滅菌開窓ドレープで覆います。皮膚を切開し、筋肉を反映します。マニピュレーターを脳定位固定アームに置き、ターゲットの脳領域を狙うように配置し、滅菌したペンで頭蓋骨の開頭位置をマークします。 定位固定マニピュレーターを取り外し、開頭術を行います。必要に応じて硬膜を切開します(例:溝のランドマークを視覚化するため)。マニピュレータを定位固定装置アームに戻します。 ベクター溶液の負荷(図1C)ベクター溶液をP20ピペッターで滅菌したPCRチューブに、気泡を避けて静かに移します。 斜めの先端を下に向けて、垂直方向の定位固定装置ホルダーにカニューレを取り付けます。1 mLルアーロックシリンジをカニューレの皮下注射針ハブに接続します。 カニューレの斜角の先端をベクター溶液に浸します。注意: シリンジはすでに取り付けられているはずです。この時点でそれを添付すると、ベクトル解に気泡が導入されます。 1mlシリンジで穏やかな負圧を適用することにより、溶液をカニューレに入れます。溶液と空気の間のメニスカスを視覚的に追跡します。 ベクター溶液がロードされたら、溶液がニードルハブに到達するまで穏やかな負圧を続けます。1 mLシリンジを取り外し、着色されたミネラルオイルを皮下注射針ハブに注入します。注意: オイルは、針ハブの内壁に沿ってゆっくりと注入して、ベクター溶液で透明なメニスカスを形成し、気泡を避ける必要があります。 皮下注射針ハブを3方向ルアーロック活栓の2つの開いているポートの1つに取り付けます。注意: 皮下注射針を閉じたポートに取り付けると、オイルの後ろに不要な空気圧が導入されます。 皮下注射針ハブに接続されているポートを閉じ、1 mLシリンジに空気を入れて、他の2つのポートのいずれかに取り付けます。最後に、活栓の残りのポートを閉じて、シリンジをカニューレに接続します。 カニューレにゆっくりと空気を押し込みます。PTFEチューブの鈍い針の先端に着色油が現れたら、溶液と着色油の間の空気を確認します。 空気が存在する場合は、シリンジに負圧を加えて、着色されたオイルをニードルハブに戻します。気泡を取り除き、斜めのカニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで陽圧を適用します。 1 mLシリンジを取り外してオイルの後ろの不要な空気圧を解放し、活栓を閉じて、ベクターが重力によってカニューレから出るのを防ぎます。 プラスチック定規をPTFEチューブにテープで固定して、射出中のメニスカスの動きを測定します(図1B、D、F)。 標的脳領域へのカニューレ挿入(図1B)カニューレを定位固定装置マニピュレーターに取り付けます。 ポンプチューブ(ルアーロックコネクタで終端)を非滅菌アシスタントから外科医に手動で移します。外科医は、滅菌スリーブの壁を通してルアーロックコネクタをつかみ、2番目の滅菌活栓をコネクタに取り付け、スリーブをしっかりとテープで固定してから、スリーブのカラーを落とし、重力によってチューブに沿って伸びるようにする必要があります。 カニューレチューブに取り付けられた活栓をエアポンプに取り付けられた活栓に接続します。エアポンプを低圧に設定して電源を入れ、オイルがカニューレを通って進み、カニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで圧力を上げます。 PTFEチューブのプラスチック定規の位置を調整して、射出中のメニスカスの動きを測定します。 定位固定装置マニピュレーターでカニューレを押し下げ、先端が表面(硬膜または軟膜)に到達する深さを記録します。 カニューレを最も深い部位まで運転し、トラックに沿って注入します。表面がくぼみます。表面皮質を注入する場合は、可能であれば手術用顕微鏡または拡大ルーペを使用して、カニューレが表面に浸透していることを視覚的に確認します。 組織の圧迫によるミスターゲティングを最小限に抑えるには、カニューレをゆっくりと(1 mm / min)、すばやく(0.5 mm / s)駆動し、下部で1〜5分間待つか、最も深い注入部位を500 μmオーバーシュートしてから引っ込めます。 注射0.5 μLのベクター溶液を電動エアポンプで10〜30秒かけて注入します。PTFEチューブ内の着色油とベクター溶液の間のメニスカスを追跡して、注入の流れを確認します。 1分間待ってから、カニューレをトラックに沿った次の注射部位に引き込みます。 最後の注入後、ベクター流出を避けるためにカニューレを10分間そのままにします。 カニューレを引っ込めて、バイオハザード鋭利物の容器に捨てます。 オプションで、ベクター注入部位の近くに少量(≤1 μL)の蛍光マイクロビーズを注入して、死後の注入部位の識別を容易にします。 他の場所にある他のベクトル解に対して、必要に応じてこの手順を繰り返します(図2B)。 手術終了硬膜、筋肉、皮膚を縫合します。 猿を脳定位固定装置フレームから取り外し、すべてのモニターケーブルを取り外します。 サルをイソフルラン麻酔から外し、嚥下反射が戻った後に抜管します。. 術後治療(3〜5日間のメロキシカムおよび7〜10日間のセファレキシン)を提供する。安定した直立座位を維持できるようになるまで、少なくとも10分ごとに動物を監視します。 3.覚醒行動動物に対する手術とAAVベクター注入(図1D) 注:この技術の変形は、以下に説明するように、覚醒して行動するサルの脳に注射するために使用できます。 録音による同時注入注射部位での電気的活動を記録するには、カニューレの外側をエポキシ(底~15 mm)とポリイミドチューブ(残り長さ)でコーティングします。先端からエポキシをこすり落として、先端の金属を明らかにします(インジェクトロード、 図1F)2。あるいは、カニューレと別の細胞外電極を並べてダブルバレルガイドチューブに挿入します(ダブルバレルガイドチューブ、 図1E)。 標的脳領域へのカニューレ挿入。サルを実験ブースに入れ、頭の動きを制限し、標準的な技術を使用して頭蓋に取り付けられた記録チャンバーを清掃します。 ガイドチューブをマイクロドライブに固定します。注射カニューレをガイドチューブに挿入します。 先端がガイドチューブから突き出るまでカニューレを進めます。 活栓を電動エアポンプに接続します。システム機能の適正確認は、エアーポンプで先端からベクター溶液を一滴押し込み、オイルベクター溶液メニスカスの動きを確認します。 カニューレをガイドチューブに~5mm引き出して、脳へのチューブ挿入中の損傷から保護します。ガイドチューブを脳に挿入します。 マイクロドライブを使用して、注射する部位にカニューレを駆動します。電気記録(図2C)または刺激のいずれかによって標的部位を特定します。 図1:手術と装置のセットアップ 。 (A)注射カニューレ。カニューレの各部分が示されています。右下の挿入図:カニューレ先端の拡大写真、スケールバー:500μm。 (B)麻酔をかけたサルの手術セットアップ。サルは外科用ドレープの下の定位固定装置フレームに入れられます。人工呼吸器(V)、静脈ライン(IV)、血圧計(BP)、および酸素飽和度モニター(O2)がサルに接続されている。注射カニューレは、定位固定装置マイクロマニピュレーターを用いて標的領域に挿入される。ベクター溶液は、エアコンプレッサー(左下の挿入図、青)に結合された電動エアポンプ(左下の挿入図、茶色)によって注入されます。プラスチック定規(上部挿入図)をPTFEチューブにテープで固定し、射出中の着色油(上部挿入図、赤色)とベクター溶液(上部挿入図、透明)の間のメニスカスの動きを測定します。(C)ベクター溶液をカニューレにロードするためのセットアップ。(D)実験ブースでベクター溶液を注入中のサル。動物の頭は3つの安定化ポストによって所定の位置に保持され、目の位置は強膜サーチコイルシステムによって記録されます。注入カニューレを保持し、微小電極ホルダー/ドライバーを使用してターゲットの深さまで駆動します。注入は、着色油とベクター溶液の間のメニスカスをUSBカメラを通して監視することによって制御される(挿入図)。(E)ダブルバレルガイドチューブインジェクション。ダブルバレルガイドチューブホルダー/ドライバーは、注射カニューレと微小電極を保持します(挿入図を参照)。(F)インジェクトロード。エポキシコートをこすることによって露出したカニューレの先端の金属は、ニューロンへの電気的アクセスを提供します(挿入図、スケールバー:500μm)。(G)レーザー刺激のセットアップ。ダブルバレルガイドチューブホルダー/ドライバーは、光ファイバーと微小電極の両方を保持します(挿入図を参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:AAV注射部位の図。 (A)マカカ・ネメストリナの一次運動野と一次視覚野の注射部位を示す脳矢状切片MR画像。(B)対応するアトラスプレートの背側表面からの眺めは、中央溝(一次運動皮質)および一次視覚野に対するカニューレの配置を示しています。(C)上丘への注入によるユニット記録。注入前に分離されたユニット(右上)は、注入後(右下)に消えました。(D)インジェクショントラック(白い矢印)。スケールバー:500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 組織学のための脳組織処理 導入遺伝子発現を最大化するために、注射後6〜8週間待ちます。注:最適な持続時間は、実験で使用された正確なウイルスベクターによって異なります。 従来の組織学的手法を使用して脳を処理し、形質導入効率と選択性を評価します5,6,7。