在麻醉和清醒行为的非人灵长类动物大脑中注射用于光遗传学的AAV载体

所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并超过了实验动物资源研究所和国际实验动物护理评估和认证协会建议的最低要求。所有程序均由华盛顿大学动物护理和使用委员会评估和批准（UW IACUC协议#4167-01）。五只健康的猕猴（2只 猕猴，3只 猕猴;雄性，4-11岁）参加了这项研究。所有外科手术都使用无菌器械和技术。 1. 制作套管（图 1A） 每个部分的准备用圆盘研磨机钝化皮下注射针头（30 G，13 mm长）的尖端。 将一根不锈钢管（30 G，内径 = 0.16 mm，外径 = 0.31 mm）切割成适合目标大脑区域深度的长度（25 mm 非常适合注射大脑皮层的背表面）。用圆盘研磨机将切割管的一端倾斜并平滑另一端。用拉刀对管子内部进行毛刺。 将聚四氟乙烯 （PFTE） 管（内径 = 0.23 mm ± 0.02 mm，壁 = 0.23 mm ± 0.02 mm，1 mm 对应于 42 nL ± 7 nL 流体）切割成适合要加载的载体溶液量的长度（1 μL 载体溶液占用 24 mm 管）。通过插入钝的皮下注射针头来激活PTFE管的两端。 将钝的皮下注射针头插入PTFE管的一端约5毫米。将不锈钢管的未斜面端插入另一端约5 mm（图1A）。 执行注射前测试。通过套管的皮下注射针轮注入过滤水。确认水从尖端流出斜面不锈钢管，并且水不会从任一连接处泄漏。 2. 麻醉动物注射程序 手术准备使用 材料表中的程序对手术器械和用品进行消毒。 如果需要，进行头部MRI以针对深部脑结构（图2A）。 手术前立即用氯胺酮（10-15mg / kg）镇静动物，并肌内注射抗生素（头孢唑林）和镇痛药（缓释丁丙诺啡和美洛昔康）。然后，通过静脉注射 （IV） 导管在隐静脉或头静脉中输送丙泊酚。 插管动物并将其转变为异氟醚气体。通过稳定的心率、血压、呼吸频率、骨骼肌松弛以及无睑反射或戒断反射来确认适当的麻醉。 剃掉动物的头。在角膜上涂抹人工泪膏以防止干燥。 注射区准备将动物的头部放在立体定位框架中。用纱布海绵将手术磨砂液涂抹在剃光的皮肤上，轻轻按压以释放任何碎屑，然后用异丙醇冲洗。重复此过程三次。用无菌开窗窗帘覆盖动物。切开皮肤并反射肌肉。将机械手放在立体定位臂上，将其定位以瞄准目标大脑区域，并用无菌笔在颅骨上标记开颅位置。 取下立体定位操纵器并进行开颅手术。如果需要，切开硬脑膜（例如，可视化脑沟标志）。将机械手返回到立体定位臂。 载体溶液加载（图1C）用P20移液器将载体溶液轻轻转移到灭菌的PCR管中，避免气泡。 将套管连接到垂直方向的立体定位支架上，斜面尖端朝下。将 1 mL 鲁尔锁注射器连接到套管的皮下注射针轮毂。 将套管的斜尖浸入矢量溶液中。注意：注射器应该已经连接;此时连接它会将气泡引入矢量溶液中。 用1ml注射器施加温和的负压，将溶液装入套管中。直观地跟踪溶液和空气之间的弯月面。 加载矢量溶液后，继续温和的负压，直到溶液到达针轮毂。取出 1 mL 注射器并将有色矿物油注入皮下注射针轮毂。注意：应沿针毂内壁缓慢注入油，以与矢量溶液形成清晰的弯月面，并避免气泡。 将皮下注射针轮毂连接到 3 向鲁尔锁旋塞阀的两个开放端口之一。注意：将皮下注射针头连接到关闭的端口会在油后面引入不需要的气压。 关闭连接到皮下注射针头集线器的端口，用空气填充 1 mL 注射器，并将其连接到其他两个端口之一。最后，关闭旋塞阀的剩余端口，将注射器连接到套管。 慢慢地将空气推入套管。一旦有色油出现在PTFE管中的钝针尖端，请检查溶液和有色油之间的空气。 如果存在空气，则对注射器施加负压，将彩色油返回到针轮毂中。去除气泡并施加正压，直到在斜面套管尖端可见一滴矢量溶液。 取下 1 mL 注射器以释放油后面不需要的气压，并关闭旋塞阀以防止载体因重力而离开套管。 将塑料尺子粘在PTFE管上，以测量注射过程中弯月面的运动（图1B，D，F）。 套管插入目标大脑区域（图1B）将套管固定在立体定位操纵器上。 手动将泵管（终止于鲁尔锁连接器）从非无菌助手转移到外科医生。外科医生应通过无菌套管的壁抓住鲁尔锁接头，将第二个无菌旋塞阀固定在连接器上，将套管紧紧地粘在其周围，然后放下套筒的衣领，使其在重力作用下沿管子延伸。 将连接到套管的旋塞阀连接到连接到气泵的旋塞阀。将气泵设置为低压，将其打开并增加压力，直到油通过套管并在套管尖端可见一滴矢量溶液。 调整PTFE管上的塑料尺位置，以测量注射过程中弯月面的运动。 用立体定位操纵器向下驱动套管，并记录尖端到达表面（硬脑膜或软脑膜）的深度。 将套管驱动到最深的部位，沿着轨道注射。表面会凹陷。如果注射表面皮层，请用手术显微镜或放大镜（如果有）目视确认套管已穿透表面。 为了尽量减少由于组织压迫引起的误靶，缓慢（1 mm / min），快速（0.5 mm / s）驱动套管，在底部等待1-5分钟，或超过最深的注射部位500μm然后缩回。 注射用电动气泵在 10-30 秒内注入 0.5 μL 载体溶液。通过跟踪有色油和PTFE管中的载体溶液之间的弯月面来确认注射流量。 等待1分钟，然后将套管缩回轨道上的下一个注射部位。 最后一次注射后，将套管留在原位10分钟，以避免向量外排。 收回套管并将其丢弃在生物危害锐器容器中。 可选地，在载体注射部位附近注入少量（≤1μL）荧光微珠，以方便尸检后识别注射部位。 根据需要对其他位置的其他矢量溶液重复此过程（图2B）。 手术结束缝合硬脑膜、肌肉和皮肤。 从立体定位框架中取出猴子并卸下所有显示器电缆。 将猴子从异氟烷麻醉中取出，并在吞咽反射恢复后拔管。 提供术后治疗（美洛昔康3-5天和头孢氨苄7-10天）。每 10 分钟至少监测一次动物，直到它能够保持稳定的直立坐姿。 3.清醒行为动物的手术和AAV载体注射（图1D） 注意：该技术的一种变体可用于将注射到清醒的行为猴子的大脑中，如下所述。 同时注射和记录为了记录注射部位的电活动，请在套管的外部涂上环氧树脂（底部~15毫米）和聚酰亚胺管（剩余长度）。通过从尖端刮下环氧树脂来露出尖端的金属（注射， 图1F）2。或者，将套管和单独的细胞外电极并排插入双管导管（双管导管， 图1E）。 套管插入目标大脑区域。将猴子放在实验室中，限制头部的移动，并使用标准技术清洁安装在颅骨上的记录室。 将导管固定到微型驱动器上。将注射套管插入导管。 推进套管，直到尖端从导管突出。 将旋塞阀连接到电动气泵。要确认系统功能正常，请使用气泵从尖端推一滴载体溶液，并确认油载体溶液弯月面的移动。 将套管~5毫米撤回导管中，以保护其在管插入大脑期间免受损坏。将导管插入大脑。 使用微型驱动器将套管驱动到要注射的部位。通过电记录（图2C）或刺激确定目标部位。 图1：手术和器械的设置 。 （A）注射套管。指示套管的每个部分。右下角插图：套管尖端的放大图片，比例尺：500 μm。 （B）麻醉猴的手术设置。将猴子放置在手术单下的立体定位框架中。呼吸机（V），静脉输液管（IV），血压监测仪（BP）和氧饱和度监测仪（O2）连接到猴子。使用立体定位显微操纵器将注射套管插入目标区域。矢量溶液由电动气泵（左下插图，棕色）与空气压缩机（左下插图，蓝色）耦合注入。将塑料尺（顶部插图）粘在PTFE管上，以测量注射过程中有色油（顶部插图，红色）和矢量溶液（顶部插图，透明）之间的弯月面运动。（C）设置以将矢量溶液加载到套管中。（D）一只猴子在实验室注射载体溶液。动物的头部由三个稳定柱固定到位，眼睛位置由巩膜搜索线圈系统记录。使用微电极支架/驱动器保持注射套管并将其驱动到目标深度。通过USB相机（插图）监测有色油和载体溶液之间的弯月面来控制注射。（五）双筒导管喷射。双桶导管支架/驱动器固定注射套管和微电极（见插图）。（F） 注射。通过刮擦环氧涂层暴露在套管尖端的金属为神经元提供电通道（插图，比例尺：500 μm）。（G） 激光刺激设置。双筒导管支架/驱动器同时容纳光纤和微电极（见插图）。 请点击此处查看此图的大图。 图2：AAV注射部位图 。 （A）脑MR图像的矢状部分，显示 猕猴的主要运动皮层和初级视觉皮层中的注射部位。（B）从相应Atlas板上的背表面查看，显示套管相对于中央沟（初级运动皮层）和初级视觉皮层的位置。（C）在上丘注射的单元记录。注射前分离的单元（右上）在注射后消失（右下）。（D） 注射轨道（白色箭头）。比例尺：500 μm。 请点击此处查看此图的大图。 4. 用于组织学的脑组织处理 注射后等待6-8周，以最大限度地提高转基因表达。注意：最佳持续时间取决于实验中使用的确切病毒载体。 使用常规组织学技术处理大脑以评估转导效率和选择性5，6，7。