그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인
Summary
여기서는 EMBL 그르노블의 HTX 연구소의 CrystalDirect 기술을 기반으로 단백질-투 구조, 신속한 리간드 단백질 복합 분석 및 대규모 단편 스크리닝을 위해 자동화된 거대 분자 결정도 파이프라인을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
EMBL 그르노블은 전 세계 사용자에게 높은 처리량 결정화 서비스를 제공하는 대규모 사용자 시설인 고처리량 결정화 연구소(HTX Lab)를 운영하고 있습니다. HTX 연구소는 거시 분자 결정학의 새로운 방법의 개발에 강한 초점을 가지고있다. 고처리량 결정화 플랫폼, 완전 자동화된 결정 마운팅 및 냉동 냉각을 위한 CrystalDirect 기술, 인터넷을 통해 원격으로 작동할 수 있는 거대 분자 결정예촬영을 위한 완전 자동화 파이프라인을 개발했습니다. 여기에는 새로운 구조물의 측정을 위한 단백질-구조 파이프라인, 약용 화학을 지원하는 단백질 리간드 복합체의 신속한 특성화를 위한 파이프라인, 1000개 이상의 단편 라이브러리평가를 가능하게 하는 대규모 자동화된 단편 스크리닝 파이프라인이 포함됩니다. 여기에서는 이러한 리소스에 액세스하고 사용하는 방법을 설명합니다.
Introduction
자동화는 결정화에서 회절 데이터 수집 및처리1,2,3,4,5,6,7,8,9,샘플 장착10,11,12에 대한 다수의 기술을 포함하는 거대 분자 결정학 실험 공정의 모든 단계에서 도입되었습니다. ,13,14,15,16,17. 이는 결정적 구조가 얻어지는 속도를 가속화할 뿐만 아니라 구조 유도 약물 설계18,19,20,21,22, 23,24와같은 응용 을 간소화하는 데 기여했다. 이 원고에서는 그르노블의 HTX 연구소에서 사용할 수 있는 자동화된 결정예 파이프라인의 측면과 기본 기술에 대해 설명합니다.
EMBL 그르노블의 HTX 연구소는 유럽에서 결정화 심사를 위한 가장 큰 학술 시설 중 하나입니다. 유럽에서 가장 뛰어난 엑스레이 빔과 높은 플럭스 중성자 빔을 제공하는 인스티투트 라우랑게빈(ILL)을 생산하는 유럽 싱크로트론 방사선 시설(ESRF)과 함께 유럽 광자 및 중성자(EPN) 캠퍼스에 공동 배치되어 있습니다. HTX 연구소는 2003년 운영이 시작된 이래 800명 이상의 과학자에게 서비스를 제공하고 연간 1,000개 이상의 샘플을 처리했습니다. HTX 연구소는 샘플 평가 및 품질관리(25,26) 및 CrystalDirect 기술을 포함한 거대 분자 결정학의 새로운 방법의 개발에 중점을 두고 있으며,15,16,17의완전 자동화된 결정 장착 및 처리를 가능하게 한다. HTX 연구소는 또한 결정화와 싱크로트론 데이터 수집 시설 간의 자동화된 통신을 제공하는 웹 기반 실험실 정보 시스템인 CRIMS(Crystallographic Information Management System)를 개발하여 순수 단백질에서 회절 데이터까지 전체 샘플 주기에 걸쳐 중단 없는 정보 흐름을 가능하게 합니다. HTX 시설, CrystalDirect 기술 및 CRIMS 소프트웨어의 용량을 결합하여 결정화 스크리닝, 결정 최적화, 자동 결정 수확 처리 및 냉동 냉각 및 X선 데이터 수집을 웹 브라우저를 통해 원격으로 작동할 수 있는 단일 및 연속 워크플로우로 통합하는 완전 자동화된 단백질-구조 파이프라인을 개발했습니다. 이러한 파이프라인은 새로운 구조의 신속한 측정, 단백질 리간드 복합체의 특성화 및 X선 결정학을 통한 대규모 화합물 및 단편 스크리닝을 지원하기 위해 적용될 수 있습니다.
HTX 연구소에는 용해성 및 멤브레인 단백질의 결정화를 가능하게 하는 LCP 모듈, 결정화 스크린을 준비하는 로봇 액체 처리 스테이션 2개, 작동 사이클당 최대 400개의 냉동 샘플 핀을 생산하고 저장할 수 있는 2개의 자동화된 CrystalDirect 결정 수확기(LCP 모듈 포함)가 장착되어 있습니다. 과학자들은 익스프레스 택배를 통해 샘플을 시설로 보내며 HTX 연구소의 전담 기술자에 의해 처리됩니다. 과학자들은 CRIMS 시스템에서 제공하는 웹 인터페이스를 통해 결정화 스크리닝 및 최적화 실험을 원격으로 설계할 수 있습니다. 이 인터페이스를 통해 특정 샘플 요구 사항에 맞게 시설에서 사용할 수 있는 광범위한 매개 변수 및 실험 프로토콜 중에서 선택할 수 있습니다. 모든 실험 매개 변수와 함께 결과를 실시간으로 사용할 수 있습니다. 수신된모든 샘플은 시료25,26,27의결정화 가능성을 추정할 수 있는 특별히 개발된 방법을 통해 분석된다. 이 분석 의 결과에 기초하여 특정 권장 사항은 최적의 잠복기 온도 및 가능한 샘플 최적화 실험에 관한 사용자에게 이루어집니다. 결정화 실험이 설정되면 과학자는 웹을 통해 서로 다른 시점에서 수집된 결정화 이미지를 보고 결과를 평가할 수 있습니다. X선 회절 실험에 적합한 결정이 확인되면 과학자들은 전용 인터페이스를 사용하여 CrystalDirect 로봇에 의해 실행되는 크리스탈 장착 계획을 수립할 수 있습니다.
CrystalDirect 기술은 수정된 증기 확산 결정화 마이크로플레이트와 레이저 빔을 사용하여 절전 가능한 회절 호환을 통해 결정화 및 데이터수집(15,16,17)사이에 존재하는 자동화 격차를 해소하는 것을 지원합니다. 간단히 말해서, 크리스탈은 수정된 증기 확산 플레이트인 CrystalDirect 마이크로플레이트에서 재배됩니다. 크리스탈이 나타나면 크리스탈이 포함된 필름 조각을 소비하고, 표준 회절 데이터 수집 핀에 부착하고, 질소 가스 스트림에서 저온 냉각을 위해 레이저 빔을 자동으로 적용합니다(Zander et al. 2016 및 https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 참조). 이 기술은 수동 또는 반자동 결정 장착 프로토콜에 비해 여러 가지 추가적인 이점을 가지고 있습니다. 예를 들어, 결정의 크기와 모양은 문제가 되지 않아 큰 결정이나 미세 결정을 수확하기가 똑같이 쉬워지며, 기술이 작동하는 특별한 방법(참조 17, Zander 등 참조 참조)으로 인해 저온 보호제의 사용을 피할 수 있는 경우가 많습니다(참조 참조 17, Zander 등 외.참조), X-ray 회절 분석이 훨씬 간단합니다. 레이저 빔은 또한 결정이 클러스터에서 성장하거나 예를 들어 상피 성장을 표시 할 때 샘플의 가장 좋은 부분을 선택하는 수술 도구로 사용할 수 있습니다. CrystalDirect 기술은 자동화된 담그실험(17)에도사용할 수 있습니다. 작은 분자 또는 다른 화학 물질을 가진 솔루션의 전달을 결정에 전달. 이를 통해 완전 자동화된 대규모 화합물 및 단편 스크리닝을 지원할 수 있습니다. 크리스탈다이렉트 로봇에 의해 크리스탈을 수확하고 극저온으로 채우면 전 세계 대부분의 싱크로나이 거대 분자 결정학 빔라인과 호환되는 SPINE 또는 유니퍽 퍽으로 옮겨질 수 있습니다. 이 시스템은 완전 자율적으로 최대 400핀(극저온 스토리지 Dewar 용량)을 수확할 수 있습니다. CRIMS는 공정 중에 수확기 로봇과 통신하고 크리스탈 샘플 (퍽 및 핀)의 자동 추적을 제공합니다. 퍽은 샘플 관리를 용이하게하기 위해 바코드와 RFID 태그가 모두 표시되어있습니다(21,28).
CRIMS는 유럽과 세계29의많은 싱크로트론에서 X선 데이터 수집 관리 및 처리를 지원하는 ISPyB 시스템과의 자동화된 통신을 지원하는 애플리케이션 프로그램 인터페이스(API)를 제공한다. 자동화된 결정 수확이 완료된 후, 과학자들은 결정 시료(퍽)를 선택하고 ESRF(그르노블, 프랑스)7,8,9 또는 페트라 III 싱크로트론(함부르크, 독일)18,19에서거대 분자 결정학 빔라인에 대한 시료 선적을 생성할 수 있다. CRIMS는 미리 선택된 데이터 수집 매개 변수와 함께 선택한 빔라인 샘플에 해당하는 데이터를 싱크로트론 정보 시스템으로 전송합니다. 샘플이 선택한 싱크로트론 빔라인에 도달하면, X선 데이터 수집은 원격 빔라인 작동 또는 완전 자동화된 방식으로 수동으로 수행됩니다(즉, 합동 EMBL ESRF 조인트 구조 생물학 그룹(JSBG)에 의해 작동하는 ESRF8의 MASSIF-1 빔라인에서). 데이터 수집 후 CRIMS는 싱크로트론 데이터 처리 시스템에서 수행된 초기 데이터 처리 결과와 함께 데이터 수집 결과에 대한 정보를 자동으로 검색하고 편리한 사용자 인터페이스를 통해 과학자에게 제공합니다.
HTX 연구소는 이러한 자동화된 파이프라인을 적용하여 세 가지 응용 분야, 새로운 구조의 신속한 결정, 단백질 리간드 복합체의 신속한 특성화, 대규모 화합물 및 단편 스크리닝을 지원합니다. 아래에서 우리는 그것을 사용하고 운영하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 자동화된 결정화 파이프라인은 다양한 자금 조달 프로그램을 통해 전 세계 연구자들이 이용할 수 있습니다. 현재, 결정화 실험 및 CrystalDirect 기술에 대한 자금 지원은 iNEXT 디스커버리 프로그램 및 지시-ERIC에 적용하여 얻을 수 있으며, ESRF의 거대 분자 결정빔라인에 대한 액세스는 ESRF 사용자 액세스 프로그램을 통해 지원된다. 이 접근법은 결정 성장과 측정 사이의 지연을 최소화하고, 단백질 생산 및 결정화 조건의 회절 기반 최적화를 요구하는 매우 도전적인 프로젝트의 진행을 가속화하고, 결정화, 결정 처리 및 빔 라인 작동과 관련된 복잡한 작업에서 과학자를 해방하여 비 전문가 그룹이 결정학에 더 쉽게 접근할 수 있게 합니다. 또한 결정화 첨가제, 해착제 또는 공동 결정화 실험을 통한 화합물 스크리닝의 신속한 탐색에 사용될 수 있다. 대부분의 결정학 프로젝트는 이 접근법의 혜택을 받을 수 있지만, 일부 샘플은 자동화 또는 여기에 제시된 파이프라인에 대한 특수 프로토콜이 필요할 수 있습니다(예: 미세유체 시스템 또는 고도로 특수화된 결정화 장치 또는 시료가 매우 비열하며 발송을 용납하지 않는 샘플).
CrystalDirect 기술은 또한 작은 분자 표적 복합체의 특성화를 위해 자동 결정 담그기17을 가능하게 합니다. 이를 위해, 작은 조리개는 수확 공정 전에 레이저로 생성되고 원하는 화학 물질을 포함하는 용액의 한 방울(즉, 페이징 에이전트 또는 잠재적 리간드)이 위에 첨가되어 접촉하여 입력하고 결국 결정화 용액으로 확산됩니다. 화학 용액은 물, DMSO 또는 기타 유기 용매로 제조 될 수 있습니다. 특정 인큐베이션 시간 후에 결정은 전술한 바와 같이 회절에 의해 수확및 분석될 수 있다. 이러한 접근법은 구조 기반 약물 설계의 맥락에서 리간드 단백질 복합체의 신속한 특성화뿐만 아니라 대규모 화합물 및 단편 스크리닝에도 적용되었다. 후자의 경우 수백~100개 이상의 조각라이브러리를 빠르게 분석할 수 있습니다. 여기에 제시되지 않은 특정 CRIMS 인터페이스는 크리스탈 담그기 실험의 설계 및 자동화 된 추적을 용이하게하며, 글로벌 Phasing Ltd(U.K)가 개발한 CRIMS 소프트웨어와 Pipedream 소프트웨어 제품군 간의 통합을 통해 수백 개의 데이터 집합에 대한 자동화된 데이터 처리, 구체화, 리간드 식별 및 구조 개선을 병렬로 구현하고 데이터 분석 및 해석32,33을 간소화할 수 있습니다. . 예를 들어, 이 파이프라인은 최근 인간 아프리카 의 트리파노소미아증을 유발하는 기생충의 핵심 효소인 Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase의 활성 부위 및 여러 알로스터릭 부위에 결합하는 파편의 식별에 적용되었다.
여기에 제시된 파이프라인은 구조 생물학에서 발견의 속도를 가속화하고 거시분자 결정학이 더 많은 연구 그룹에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 데 기여할 수 있습니다. 또한 대규모 화합물 및 단편 스크리닝을 촉진함으로써 번역 연구를 촉진하고 약물 발견 과정을 가속화하여 더 많은 수의 표적에 대해 더 우수하고 안전한 약물의 개발을 용이하게 할 수 있습니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 ESRF 거대 분자 빔라인의 사용 및 운영에 대한 지원을 위한 공동 EMBL-ESRF 구조 생물학 그룹 (JSBG)에 감사드립니다. 우리는 ESRF와 토마스 슈나이더와 페트라III 싱크로트론 (DESY, 함부르크, 독일)의 P14에서 데이터 수집을 통해 우수한 지원을 위한 ESRF-1 빔라인과 EMBL 함부르크 팀의 데이터 수집을 지원하는 매튜 볼러에게 감사드립니다. 크리스탈 다이렉트 수확기는 EMBL 그르노블의 계측팀과 협력하여 개발되었습니다. 이 프로젝트는 iNEXT 프로젝트 iNEXT(그랜트 노 653706)와 iNEXT 디스커버리(그랜트 없음 871037)와 부스터 프로그램을 통해 레지온 오베르뉴-론 알프스(Région Auvergne-Rhône-Alpes)에 따라 유럽 커뮤니티H2020 프로그램의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
| CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
| Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
| Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
| Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
| Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
| UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
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