ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי
Summary
חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.
Abstract
אמינופפטידאז N חזירי (APN), מטלופפטידאז הקשור לקרום ונמצא בשפע ברירית המעי הדק, יכול ליזום תגובה חיסונית רירית ללא כל הפרעה כגון ביטוי חלבון נמוך, חוסר פעילות אנזימים או שינויים מבניים. זה הופך את APN למועמד אטרקטיבי בפיתוח חיסונים המכוונים באופן סלקטיבי לאפיתל הרירית. מחקרים קודמים הראו כי APN הוא חלבון קולטן הן עבור Escherichia coli אנטרוטוקסיגני (E. coli) F4 והן עבור וירוס גסטרואנטריטיס הניתן להעברה. לפיכך, APN מראה הבטחה בפיתוח הצמדות נוגדנים-תרופות או חיסונים חדשניים המבוססים על נוגדנים ספציפיים ל-APN. במחקר זה, השווינו ייצור של נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים ל-APN (mAbs) באמצעות טכנולוגיית היברידיומה מסורתית ושיטת ביטוי נוגדנים רקומביננטית. הקמנו גם קו תאים של שחלות אוגר סיניות (CHO) עם זיהום יציב באמצעות pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN וזן BL21(DE3) של ביטוי E. coli המכיל את וקטור pET28a (+)-rAbs-APN. התוצאות מראות כי נוגדנים המבוטאים בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובתאי mAbs המיוצרים באמצעות היברידיות יכולים לזהות את חלבון APN ולהיקשר אליו. זה מספק את הבסיס להבהרה נוספת של פונקציית קולטן APN לפיתוח טיפולים המכוונים לאפיטופים ספציפיים שונים של APN.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), אנזים מאיר ירח השייך למשפחת Metalloproteinase M1, פועל כסמן גידול, קולטן ומולקולת איתות באמצעות מסלולים תלויי אנזים ובלתי תלויים באנזימים 1,2. בנוסף לניתוק שאריות חומצות אמינו N-טרמינליות של פפטידים ביו-אקטיביים שונים לוויסות פעילותם הביולוגית, APN ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות דלקתיות שונות. APN משתתף בעיבוד אנטיגן והצגתו על ידי פפטידים גזורים הנקשרים בחוזקה למולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג II 2,3. APN גם מפעיל השפעות אנטי דלקתיות על ידי קשירה עם קולטנים מצומדים לחלבון G המשתתפים בהעברת אותות מרובים, מווסת הפרשת ציטוקינים, ותורם לפאגוציטוזה בתיווך קולטן גמא Fc בתגובה החיסונית 4,5,6,7.
כאקסופפטידאז הקשור לקרום המפוזר באופן נרחב, APN נמצא בשפע ברירית המעי הדק החזירית והוא קשור קשר הדוק עם אנדוציטוזהבתיווך קולטן 1,5,8. APN מזהה וקושר את חלבון הספייק של נגיף הגסטרואנטריטיס הניתן להעברה לצורך כניסה לתאים, ומקיים אינטראקציה ישירה עם תת-היחידה FaeG של פימבריה אנטרוטוקסיגנית Escherichia coli F4 כדי להשפיע על היצמדות חיידקים לתאים מארחים 9,10,11. לפיכך, APN הוא יעד טיפולי פוטנציאלי בטיפול במחלות זיהומיות ויראליות וחיידקיות.
מאז הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma ואסטרטגיות אחרות לייצור נוגדנים חד שבטיים (mAbs) בשנת 1975, mAbs היו בשימוש נרחב באימונותרפיה, מתן תרופות, ואבחון12,13,14. כיום, mAbs משמשים בהצלחה לטיפול במחלות, כגון סרטן, מחלות מעי דלקתיות וטרשת נפוצה12,15. בגלל הזיקה והספציפיות החזקה שלהם, mAbs יכולים להיות מטרות אידיאליות בפיתוח הצמדות נוגדנים-תרופות (ADC) או חיסונים חדשים16,17. חלבון APN הוא קריטי להעברה סלקטיבית של אנטיגנים לתאים ספציפיים, והוא יכול לעורר תגובה חיסונית רירית ספציפית וחזקה נגד פתוגנים ללא כל הפרעה, כולל ביטוי חלבון נמוך, חוסר פעילות אנזימים או שינויים מבניים 5,8,18. לכן, מוצרים טיפוליים המבוססים על mAbs ספציפיים ל-APN מראים הבטחה מפני זיהומים חיידקיים ונגיפיים. במחקר זה, אנו מתארים ייצור של mAbs ספציפי ל-APN באמצעות טכנולוגיית hybridoma, וביטוי של נוגדנים רקומביננטיים נגד APN (rAbs) באמצעות וקטורים פרוקריוטים ואוקריוטים. התוצאה מצביעה על כך שחלבון APN זוהה הן על ידי rAbs המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO והן בתאי mAbs שמקורם בהיברידיומה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השראת חסינות רירית היא אחת הגישות היעילות ביותר בנטרול פתוגנים ובמניעה וטיפול במחלות שונות. APN, חלבון הקשור לקרום בעל ביטוי גבוה ברירית המעי, מעורב בהשראת תגובה חיסונית נרכשת ובאנדוציטוזה נגיפית וחיידקיתבתיווך קולטן 1,5,8. APN משמש כחלקיקי ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק הקרן הלאומית הסינית למדע (מס ‘32072820, 31702242), מענקים ממלגת ממשלת ג’יאנגסו ללימודים בחו”ל (JS20190246) וכישרונות ברמה גבוהה של קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת יאנגז’ו, פרויקט שנוסד על ידי התוכנית האקדמית המועדפת לפיתוח מוסד להשכלה גבוהה ג’יאנגסו.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
