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Biologie

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

Published: April 13, 2021
doi:
10.3791/62293
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1Institute of Physiology, Faculty of Medicine,University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics,University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology,Medical University of Vienna

Summary

Apresentamos a preparação de fatias agudas de tecido pancreático e seu uso em microscopia de escaneamento a laser confocal para estudar a dinâmica do cálcio simultaneamente em um grande número de células vivas, durante longos períodos de tempo, e com alta resolução espástica.

Abstract

A fatia aguda de tecido pancreático do rato é uma preparação única in situ com comunicação intercelular preservada e arquitetura tecidual que implica significativamente menos alterações induzidas pela preparação do que ilhotas isoladas, acini, dutos ou células dispersas descritas em estudos in vitro típicos. Combinando a fatia aguda de tecido pancreático com imagens de cálcio de células vivas na microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), os sinais de cálcio podem ser estudados em um grande número de células endócrinas e extrinas simultaneamente, com uma resolução única ou mesmo subcelular. A sensibilidade permite a detecção de alterações e permite o estudo de ondas intercelulares e conectividade funcional, bem como o estudo da dependência das respostas fisiológicas das células em sua localização dentro da ilhota e relação paracrina com outras células. Finalmente, do ponto de vista do bem-estar animal, o registro de sinais de um grande número de células em um momento reduz o número de animais necessários em experimentos, contribuindo para a substituição, redução e princípio de refinamento 3R.

Introduction

O pâncreas mamífero é uma grande glândula exócrina e endócrina. A parte exócrina representa 96-99% do volume total do pâncreas e consiste em acini e dutos. A parte endócrina é composta por um grande número de ilhotas de Langerhans representando os 1-4% restantes do volume total do pâncreas1. A parte exócrina secreta grandes enzimas digestivas que quebram polímeros ricos em energia na comida, bem como um fluido rico em bicarbonato, que combina com outras secreções gastrointestinais para fornecer um ambiente adequado para a ação de enzimas. A parte endócrina secreta hormônios que regulam a distribuição pós-preria, o armazenamento e a liberação interprandial de nutrientes ricos em energia. Embora o tecido exocrino seja relativamente subdesenvolvido e o endócrino relativamente bem desenvolvido ao nascer, o primeiro rapidamente supera o último após o desmamar 2,3,4. Estudos iniciais da função pancreática marcaram o nascimento da fisiologia moderna, e os principais avanços metodológicos no campo têm sido seguidos por grandes quebra-panorticas científicas5. Trabalhar com pâncreas é tecnicamente desafiador devido à estrutura intrincada da glândula, mas também é uma grande motivação por causa de doenças como câncer de pâncreas, pancreatite e diabetes que apresentam grandes ameaças à saúde pública, e para as quais novas abordagens terapêuticas são necessárias.

Ilhotas isoladas6, acini 7,8 e fragmentos ductais foram desenvolvidos e utilizados por décadas como métodos padrão-ouro devido às suas vantagens em comparação com linhas celulares e células endócrinas, acinar e ductal 9,10 dispersas primárias. Apesar da função marcadamente melhorada dos coletivos celulares isolados, esses métodos ainda envolvem considerável estresse mecânico e enzimático, isolam as células do tecido circundante e, portanto, carecem de interações paracrinas e suporte mecânico, e o mais importante, são acompanhados por mudanças significativas na fisiologia normal 11,12,13 . A fatia aguda de tecido pancreático do camundongo foi desenvolvida em 2001 a partir de uma necessidade percebida de desenvolver uma plataforma experimental semelhante ao cérebro, pituitária e fatias suprarrenais com contatos intercelulares preservados, interações paracrinas, mesenquime e arquitetura tecidual, bem como sem algumas das deficiências mais importantes do método padrão ouro na pesquisa de ilhotas da época- ilhotas isoladas12, 14 anos. Entre essas deficiências estão danos nas camadas mais externas, falta de acessibilidade das áreas de ilhotas do núcleo e a necessidade de cultivo com efeitos possivelmente importantes na identidade celular e fisiologia 12,15. Além disso, o método de fatia de tecido permite estudos sobre modelos animais com arquitetura de ilhotas grosseiramente desordenada, onde é impossível isolar ilhotas, ou quando o rendimento da ilhota é extremamente baixo pelo isolamento tradicional 16,17,18,19,20,21.

Além disso, a fatia é mais adequada para estudar alterações morfológicas durante o desenvolvimento de diabetes e pancreatite, por exemplo, pois permite uma melhor visão geral de todo o tecido e também é compatível com o estudo de diferenças regionais. É importante ressaltar que, apesar do foco inicial na parte endócrina, o método de fatia de tecido permite inerentemente o estudo dos componentes exócrinos 9,22,23. Durante a primeira década após sua introdução, o método foi empregado para estudos eletrofisiológicos de células beta 14,24,25,26,27,28,29 e alfa 30,31, bem como para examinar a funcionalidade morfológica e maturada do pâncreas 2,3 . Uma década depois, em 2013, o método foi adaptado com sucesso para imagens de cálcio de células vivas de células ilhotas usando CLSM para caracterizar suas respostas à glicose32, seus padrões de conectividade funcional33, e a relação entre potencial de membrana e cálcio intracelular, combinando um corante de cálcio fluorescente com um corante potencial de membrana34. Mais tarde, no mesmo ano, o método também foi utilizado para avaliar a dinâmica do cálcio em células acinar22,35. Nos anos seguintes, as fatias de tecido pancreático têm sido utilizadas em diversos estudos e adaptadas com sucesso ao tecido suíno e humano 9,36,37,38,39,40,41. No entanto, juntos, as fatias de tecido pancreático de imagem de cálcio em geral e em ilhotas em particular – ainda é realizada principalmente por esse grupo. Uma das principais razões para isso pode estar na combinação de uma preparação tecnicamente desafiadora de fatias teciduais, a necessidade de um microscópio confocal e uma análise de dados bastante complexa. O principal objetivo do presente artigo é tornar esse método poderoso mais acessível a outros usuários em potencial.

Já existem alguns excelentes artigos metodológicos que tratam em detalhes com a preparação de fatias teciduais e o uso de fatias para estudos estruturais e de secreção, mas não para imagens de cálcio confocal 9,42,43. Portanto, este artigo foca em algumas dicas e truques adicionais durante a preparação de fatias, em etapas críticas para o sucesso do carregamento de tingimento, aquisição de imagem, bem como nos principais passos da análise básica de dados de cálcio. Portanto, essa contribuição deve ser vista como complementar e não como alternativa para o método acima mencionado. Da mesma forma, a imagem de cálcio em fatias de tecido pancreático de camundongos deve ser vista como uma abordagem experimental a ser usada para responder a perguntas específicas e, portanto, é complementar ao invés de uma alternativa absoluta para outras abordagens de imagem de cálcio na fisiologia pancreática, como dutos isolados ou acini, ilhotas isoladas, organoides, ilhotas transplantadas na câmara anterior do olho, e gravações in vivo 11,44,45,46,47,48. A promessa de imagem de cálcio em fatias de tecido pancreático de camundongos é provavelmente melhor ilustrada por gravações recentes bem sucedidas de dinâmica de cálcio em células mesenquimais de ilhotas, como pericítes49 e macrófagos50, bem como em células ductais23.

Protocol

NOTA: Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais em pesquisa. O protocolo foi aprovado pela Administração da República da Eslovênia para Segurança Alimentar, Setor Veterinário e Proteção Vegetal (número de licença: 34401-35-2018/2). 1. Preparação de fatias de tecido pancreático NOTA: A preparação de fatias agudas de tecido de pâncreas de camundongos para imagem de cálcio usando CLSM requer uma série de instrumentos, soluções diferentes, e prossegue em uma série de etapas críticas que são apresentadas esquematicamente na Figura 1 e descritas em detalhes abaixo. Figura 1: Diagrama do fluxo de trabalho. Representação esquemática de todas as etapas no processo de preparação da fatia de tecido pancreático, começando com a injeção de agarose no ducto biliar comum, seguida pela extração do pâncreas e corte. As fatias preparadas podem ser usadas para avaliar a viabilidade do tecido com um kit Live/Dead ou manchado com um sensor de cálcio. Uma vez manchados, eles estão prontos para a imagem. Gravações obtidas a partir do processo de imagem são então usadas para análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Elaboração de soluçõesNOTA: Todas as soluções devem ser preparadas com antecedência e podem ser armazenadas na geladeira a 4-8 °C por até um mês. Para a preparação e armazenamento de fatias de tecido, aproximadamente 0,5 L de solução extracelular (ECS) com glicose de 6 mM e 0,3 L de 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic tampão (HEPES). Para 1 dia de imagem de cálcio com o sistema de perifusão fixado em 1-2 mL/min de vazão, aproximadamente 0,5 L de ECS é necessário. Solução extracelular com glicose de 6 mM Prepare 1 L de ECS contendo 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM de glicose, ácido láctico 6 mM, 3 mM myo-inositol, 2,5 mM KCl, 2 mM Na pirunato, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 e 0,5 mM ácido ascorbic. Misture bem até que todos os ingredientes se dissolvam completamente. Pegue 50 μL de ECS em um tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL, coloque-o no osmômetro de acordo com as instruções do fabricante e verifique a osmolaridade.NOTA: A osmolaridade deve ser de 300-320 mOsm. Para estimular células beta, use soluções com maiores concentrações de glicose. Para garantir o valor fisiológico do pH de 7,4 durante o corte e experimentos, bolha constantemente o ECS com carbogen (ou seja, uma mistura de gás de 95% O2 e 5% CO2) à pressão barométrica. Um simples sistema de borbulha pode ser configurado anexando uma extremidade de uma tubulação de silício de 5 mm à fonte de carbogen (ou seja, um cilindro de gás pressurizado) e a outra extremidade da tubulação colocada diretamente na garrafa contendo ECS. Alternativamente, prepare um estoque de 10x contendo 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruate, 12,5 mM NaH2PO4 e 5 mM ácido ascórbico. Quando for necessário o ECS contendo 6 mM de glicose, misture 100 mL do estoque com 2 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgCl2, 0,455 mL de 13,2 M de ácido láctico e 1,08 g de glicose, e preencha com água duplamente destilada até 1 L. Se necessário, use diferentes quantidades de glicose para obter outras concentrações de glicose. Tampão HEPES com glicose de 6 mM Prepare 0,5 L de solução tamponada hepes (HBS) contendo 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM de glicose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 e 1 mM MgCl2; titulação ao pH = 7,4 com 1 M NaOH.NOTA: Se o carbogen não estiver disponível, este buffer pode ser usado para todas as etapas em vez de ECS. Agarose (1,9% c/w) Pré-aquecimento um banho de água a 40 °C. Adicione 0,475 g de agarose de ponto de fusão baixa e 25 mL de ECS contendo glicose de 6 mM a um frasco de Erlenmeyer, e coloque o frasco em um forno de micro-ondas em potência máxima por alguns segundos até que comece a ferver. Tire o frasco do forno e gire-o algumas vezes, até que a agarose se dissolva completamente. Transfira o frasco com a agarose líquida para o banho de água pré-armado a 40 °C para esfriar a agarose à temperatura desejada e mantenha-a líquida até a injeção. Segure o frasco com um anel de chumbo estabilizador.NOTA: A agarose pode ser preparada com antecedência e mantida na geladeira. Antes de usar, aqueça a agarose no forno micro-ondas até que liquefaz, e transfira o frasco de Erlenmeyer para um banho de água pré-enlagado a 40 °C. A agarose pode ser reutilizada em até 5x. Se reutilizado além de 5x, ele se tornará denso e mais difícil de injetar. Injeção de pâncreas com agaroseNOTA: As seções 1.2 e 1.3 explicam a preparação de fatias de tecido que podem ser usadas para diferentes propósitos experimentais, como imagem de cálcio, eletrofisiologia, imunohistoquímica, estudos de secreção e estudos estruturais/microanatomômicos.Encha uma seringa de 5 mL com a agarose líquida do frasco de Erlenmeyer no banho de água a partir do passo 1.1.3.2, remova quaisquer bolhas e monte uma agulha de 30 G. Proteja a agulha com uma tampa, e mantenha a seringa recheada no banho de água com a agulha voltada para baixo e todo o volume de agarose abaixo da superfície da água. Fixar a seringa com um anel de chumbo estabilizador de tal forma que o anel pressiona a seringa contra a parede do banho de água.NOTA: Tenha cuidado para não empurrar nenhuma agarose na agulha, pois ela endurecerá rapidamente e bloqueie a agulha. Se a temperatura ambiente estiver baixa, e se a injeção for realizada por uma pessoa menos experiente, aumente a temperatura do banho de água até 42 °C para ganhar algum tempo adicional para injeção. Encha um balde de gelo com gelo e coloque a garrafa contendo ECS nele. Bubble the ECS constantemente a 1,5 mL/min com carbogen a pressão barométrica e temperatura ambiente para garantir a oxigenação e um pH de 7,4. Sacrifique um rato administrando uma alta concentração de CO2 seguido de luxação cervical. Faça todos os esforços para minimizar o sofrimento animal. Trabalhando sob um estereómico, acesse o abdômen via laparotomia (Figura 2A). Gire suavemente o intestino para o lado esquerdo do mouse (da perspectiva anatômica do rato) para expor o ducto biliar comum. Use fórceps para levantar ligeiramente a parte duodenal, e encontrar a papila duodenal principal de Vater. Fixar o ducto biliar comum na papila duodenal usando um hemostat (Figura 2B,C) para evitar o vazamento de agarose do duto para o duodeno.NOTA: Para evitar o vazamento de agarose no duodeno e mais para cima e para baixo no trato gastrointestinal, coloque o hemostat de tal forma que também fixa o duodeno tanto proximal quanto distralmente da papila. É melhor usar um hemostat curvo para este fim. Com pequenas fórceps afiadas, alcance sob o ducto biliar comum, e quebre a membrana que prende o ducto ao tecido pancreático. Para melhor controle visual e injeção mais fácil, limpe o máximo de gordura e tecido conjuntivo possível do duto. Coloque o duto perpendicularmente em fórceps grandes (Figura 2D), e injete a ágarose líquida preparada na parte proximal do ducto biliar comum (Figura 2D). Certifique-se de apertar a seringa com força, pois a agarose é viscosa. Continue enchendo o pâncreas até ficar esbranquiçado e ligeiramente distendido ou por pelo menos 20-30 s.NOTA: Este é o passo mais crítico na preparação da fatia. Se houver alguma torção na árvore ductal do pâncreas, eleve suavemente ou puxe o pâncreas para longe da seringa para nivelá-los. Não decida quando parar a injeção com base no volume injetado da seringa, pois o fluxo de volta no ponto de injeção e o vazamento para a frente no duodeno são tipicamente muito maiores do que o volume injetado na árvore ductal do pâncreas. É importante ressaltar que injeções bem sucedidas podem ser realizadas com alterações praticamente imperceptíveis no volume de seringas. Retire a seringa e despeje lentamente 20 mL do ECS gelado borbulhado a 0-4 °C da garrafa para o pâncreas para esfriar o tecido e endurecer a ágarose. Extraia suavemente o pâncreas usando fórceps e uma tesoura fina e resistente. Coloque o pâncreas extraído em uma placa de Petri de 100 mm contendo ~40 mL de ECS gelado, e mova-o suavemente para lavá-lo. Transfira o pâncreas para uma placa de Petri fresca de 100 mm contendo ~40 mL de ECS gelado. Da parte bem injetada do pâncreas, que parece esbranquiçada (Figura 3A), corte até 6 blocos de tecido, 0,1-0,2 cm3 de tamanho, usando fórceps e tesouras resistentes. Limpe-os de qualquer tecido conjuntivo e gorduroso. Encha uma placa de petri de fundo anti pegajosa de 35 mm com aproximadamente 5 mL de líquido agarose a 40 °C, transfira os blocos de tecido para ele, e coloque imediatamente a placa de Petri no gelo para esfriá-la e endurecer a agarose.NOTA: A forma como os blocos de pâncreas ficam presos em agarose determina a forma como são cortados durante o corte. Experimentalistas experientes podem tentar ajustar a posição dos blocos durante os poucos momentos antes da agarose endurecer quando colocada no gelo. Depois que a agarose com os blocos de tecido endurece, gire a placa de Petri de cabeça para baixo em uma superfície lisa plana, como a tampa de uma placa de Petri de 100 mm, e remova a agarose cortando suavemente com metade de uma lâmina de barbear na margem entre a parede lateral da placa de Petri e a agarose. Com uma lâmina de barbear, corte cubos individuais de agarose, cada um contendo um bloco de tecido, tomando cuidado para que cada bloco de tecido seja cercado por agarose. Cole os blocos de agarose na placa de amostra do vibratome com cola cianoacrilato (Figura 3B). Figura 2: Injeção de agarose no ducto biliar comum. (A) Abra a cavidade abdominal e exponha os órgãos na cavidade peritoneal. (B) A parte ampliada da área incluída pelo retângulo no painel A. A mancha branca no duodeno (indicada pela seta) indica a ampola de Vater. Ilhotas de Langerhans são denotadas por pontas de flecha. (C) Fixar a ampola de Vater por um hemostato curvo, e elevá-la ligeiramente para expor e esticar suavemente o ducto biliar comum (seta). (D) Canulação do ducto biliar comum e a injeção de solução de 1,9% de agarose utilizando uma seringa de 5 mL e uma agulha de 30 G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Cortar Encha a câmara de corte do vibratome com ~0,15 L de ECS gelado, e bolha constantemente com carbogen. Cerque a câmara de corte com gelo, e adicione 2 cubos de gelo (~10 mL cada) feitos de ECS com 6 mM de glicose na câmara de corte. Monte a lâmina de barbear para cortar sobre o vibratome, e fixar a placa de amostra com blocos de agarose em seu lugar. Coloque o cortador para cortar blocos de agarose em 0,05 a 1 mm/s e 70 Hz em fatias de 140 μm de espessura com uma superfície de 20-100 mm2. Para as configurações do cortador, siga as instruções do fabricante. Imediatamente após cada etapa de corte, pause o cortador, cole delicadamente as fatias com uma escova de tinta fina e transfira-as para uma placa de Petri de 100 mm recheada com 40 mL de tampão HEPES com 6 mM de glicose à temperatura ambiente (Figura 3C).NOTA: As fatias podem ser mantidas no tampão HEPES à temperatura ambiente por pelo menos 12 h, e o buffer deve ser trocado a cada 2 h. Figura 3: Preparação e corte do tecido do pâncreas. (A) O pâncreas do rato extraído após a injeção de agarose. O tecido branco à esquerda indica uma parte bem injetada (parte duodenal), enquanto a parte mais avermelhada à direita mostra a parte insuficientemente injetada do pâncreas (parte esplênica). (B) Corte de vibratome de dois blocos de tecido do pâncreas embutidos na ágarose. (C) Corte aguda de tecido pancreático com ilhotas de Langerhans indicadas por pontas de flecha. Barra de escala = 3000 μm. (D) Corte aguda de tecido pancreático sob o microscópio leve com a ilhota de Langerhans indicada por uma ponta de flecha, o asterisco indica um ducto pancreático. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Ensaio vivo/morto usando kit de viabilidade/citoxicidade ao vivo/morto para células de mamíferos NOTA: Para alguns experimentos, é útil verificar a viabilidade das células nas fatias (Figura 4) pelo ensaio vivo/morto da seguinte forma. Siga as instruções do fabricante para descongelar frascos com reagentes do Kit de Viabilidade/Citoxicidade LIVE/DEAD e prepare soluções de trabalho de calcein AM pouco antes do uso. Use as soluções dentro de um dia. Em um tubo de centrífugas de 15 mL, misture 5 μL de 4 mM de calcein AM (Componente A), 20 μL de 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1, Componente B), e 10 mL da solução salina tamponada de Fosfato (D-PBS) de Dulbecco para preparar uma solução de trabalho contendo aproximadamente 2 μM de calcein AM e 4 μM EthD-1. Vórtice completamente. Usando uma escova de tinta fina, transfira suavemente as fatias de tecido em uma placa de Petri de 3 mL com tampão HEPES fresco para diluir a atividade de esterase do soro. Remova o buffer HEPES e cubra as fatias com 100-200 μL (ou mais, se necessário) da solução de trabalho da etapa 2.2. Incubar as fatias por 30-45 min em temperatura ambiente em uma placa de Petri fechada. Imagem as fatias de tecido usando filtros de excitação/emissão, conforme recomendado pelo fabricante. 3. Carregamento de corante de cálcio NOTA: Os corantes fluorescentes devem ser protegidos da exposição à luz durante todo o processo de preparação e carregamento do corante, bem como durante o manuseio das fatias de tecido manchado. A folha de estanho pode ser usada para cobrir tubos ou placas de Petri contendo o corante de cálcio. Preparação de corante Dissolva o conteúdo de um frasco (50 μg) do corante indicador Ca2+ celular (excitação/emissão 495/523 nm; ver a Tabela de Materiais), 7,5 μL de dimetilsulfoxida (DMSO) e 2,5 μL do polaxamer (solução de 20% em DMSO; Tabela de Materiais) em 6.667 mL de HBS contendo 6 mM de glicose em um tubo de tampa de parafuso de 15 mL.NOTA: Esta solução final contém 6 μM do corante indicador Ca2+ , 0,11% DMSO e 0,037% polaxamer. Aspirar e expulsar a solução no tubo da tampa do parafuso repetidamente com uma pipeta para 20 s; submergir o tubo em uma câmara de banho ultrassônico para 30 s, e vórtice para 30 s para melhorar a solubilização. Alíquota de 3.333 mL da solução final de corante indicador Ca2+ preparada na etapa 3.1.1 em 5 mL de placas de Petri. Carregamento de corante Transfira as fatias de tecido preparada da placa de Petri de 60 mL com HBS em pratos de Petri de 5 mL preenchidos com a solução de corante, levantando suavemente cada fatia de tecido usando um pincel fino e macio e colocando-o na solução de corante. Incubar até 10 fatias de tecido por placa de Petri. Coloque a placa de Petri carregada em uma placa orbital a temperatura ambiente definida em movimento orbital a 40 voltas por minuto por 50 minutos. Incubar as fatias na solução de corante expostas ao ar ambiente à temperatura ambiente, mas protegidas da luz cobrindo a placa de Petri com papel alumínio. Armazenamento de fatias Transfira as fatias de tecido manchado da placa de Petri de 5 mL em uma placa de Petri de 60 mL cheia de HBS sem corante, levantando-as suavemente usando um pincel fino e macio. Guarde até 20 fatias por placa de Petri.NOTA: Use as fatias de tecido para imagens neste momento. As fatias de tecido manterão o corante indicador Ca2+ por várias horas. A sobrevivência das fatias e a retenção do corante podem ser melhoradas colocando a placa de Petri em um recipiente isolado, cercado por gelo. Isso é especialmente importante se as fatias carregadas de corante forem transportadas. Além disso, troque o HBS a cada 2 horas. 4. Imagem de cálcio Configuração do microscópio confocal Escolha uma ampliação objetiva adequada dependendo do interesse do estudo. Selecione 20x e 25x (abertura numérica [NA] 0,77-1,00) para visualizar uma ilhota inteira, vários acini simultaneamente ou dutos maiores. Selecione ampliações mais altas para estudar dinâmica intracelular. Escolha o modo de aquisição para imagens de lapso de tempo (por exemplo, lapso de tempo, xyt ou modo similar). Coloque o orifício em 100-200 μm. Definir o caminho da luz para fluoroforos verdes: excitação a 488 nm, e coleta de emissão em 500-700 nm. De preferência, selecione detectores com alta eficiência quântica (por exemplo, fosfito de arsênio de gálio) sobre detectores fotomultiplier. Configuração da câmara de gravação e do sistema de perifusão Monte a câmara de gravação no estágio controlado pela temperatura do microscópio e do sistema de perifusão (configuração baseada em bomba alimentada pela gravidade ou peristáltica, volume 1 mL). Posicione a entrada e a saída nas bordas distantes da câmara de gravação para evitar a sinuosidade do perfusado dentro da câmara, e defina a entrada e a saída para valores iguais (1-2 mL/min). Evite a deriva da altura do menisco líquido e gotículas no perifusato. Defina o controle de temperatura do sistema de perifusão para 37 °C.Inicie a perifusão com a solução não estimulante e prepare as soluções estimulantes. Altere as soluções através de válvulas motorizadas ou comutando manualmente as soluções que alimentam o sistema de perifusão. Recorde de dinâmica de cálcio Transfira uma única fatia de tecido para a câmara de gravação. Imobilize a fatia de tecido com um peso de platina em forma de U com malha de nylon esticada (por exemplo, a partir de meias de nylon). Evite posicionar os fios de nylon sobre a estrutura de interesse. Localize uma ilhota/acinus/duto usando a opção brightfield. Execute imagens ao vivo para posicionar as estruturas estudadas no campo de visão e configure os parâmetros de imagem. Otimize a relação sinal-ruído ajustando a potência do laser, a amplificação do detector e a média/binning da linha para permitir a visualização das células, mantendo a potência do laser mínima. Ajuste o plano focal da gravação para ~15 μm abaixo da superfície de corte (Figura 5) para evitar a gravação de células potencialmente danificadas na superfície de corte. Adquira imagens. Defina a frequência amostral para 1-2 Hz para detectar oscilações individuais inicialmente, e use um scanner ressonante capaz de uma média de linha rápida (8-20) a uma taxa de aquisição mais alta (>10 Hz) para registrar a atividade intracelular Ca2+ ([Ca2+]IC). Permita um intervalo (por exemplo, 30% do tempo total de amostragem) entre iluminação de ponto consecutivo para evitar fototoxicidade. Registo uma imagem de alta resolução (por exemplo, 1024 x 1024 pixels, linha média > 50) antes da aquisição da série temporal (ver seção 5).NOTA: A frequência amostral de 1-2 Hz está abaixo do critério nyquist para a frequência de aquisição para a maioria das células, e a forma do sinal será subamostrada por padrão. Consulte um gráfico on-line, se disponível no software de imagem, para obter feedback instantâneo sobre a resposta de preparação, sobre-iluminação, fotobleaching e deriva mecânica. No caso de uma alta taxa de branqueamento durante a aquisição, pare a gravação e diminua a potência do laser, aumentando o ganho do detector para manter a relação sinal-ruído. No caso da deriva mecânica, verifique se há tensão entre tubos/cabos e o estágio do microscópio, bem como vazamento líquido ou alterações do volume na câmara de gravação. Opcionalmente, tente corrigir a deriva durante a aquisição manualmente; no entanto, note que isso inerentemente produzirá resultados limitados.NOTA: As células endócrinas são altamente heterogêneas em concentrações próximas ao limiar. É necessário um comprimento suficiente de estimulação para detectar a gama de atrasos de ativação/desativação em células individuais. Isso é especialmente importante para a detecção precisa de respostas off-responses seguindo protocolos altamente estimulantes. Use imagens de cálcio para discriminar funcionalmente entre células endo e exócrinas (Figura 6). Para registrar atividade transitória durante a ativação e desativação, aplique estímulos sem parar a gravação. Salve os dados após o fim da experimentação (considere usar uma função de salvamento automático). Permita um período de resfriamento antes de desligar a potência do laser para não danificar os lasers durante o procedimento de desligamento. 5. Análise dos dados Inspecione visualmente a gravação qualitativamente reproduzindo o vídeo de lapso de tempo. Verifique se há derivas de células do campo de visão ou do plano óptico. Se ocorreu uma deriva dentro do plano óptico, empregue o plugin de correção de deriva no ImageJ. Selecione regiões de interesse (ROIs) usando software de microscópio ou software de terceiros. Use a imagem de alta resolução, projeção máxima ou média de quadros como referência para selecionar ROIs. Reproduza as imagens de lapso de tempo para visualizar células que não são visíveis em imagens de referência. Posicione os ROIs de tal forma que a área selecionada de um ROI não se sobreponha às células vizinhas para evitar o cruzamento de sinal entre ROIs. Exporte os dados da série temporal como valor médio do ROI por quadro. Exportar coordenadas do ROI. Corrija os dados da série temporal para branqueamento (Figura 7A) empregando uma combinação de um ajuste exponencial e linear, conforme descrito por(1)onde x(t) denota o sinal de fluorescência em um ponto de tempo t; xcorr(t) o sinal corrigido nos pontos de tempo correspondentes; e a, b e c os parâmetros do ajuste calculados como a menor soma de quadrados entre o corr(t) e x(t). Analisar a fase de ativação e desativação da resposta (Figura 7B). Calcule a primeira derivada dos dados da série temporal e determine o zênite e o nadir do derivado correspondente à ativação e desativação, respectivamente. Alternativamente, selecione manualmente o início do aumento da fase phasic. Salve e exporte os tempos de ativação/desativação e as coordenadas celulares correspondentes. Analisar a fase do planalto (Figura 7C). Detectar oscilações individuais, limiarizando os dados brutos ou cortando o primeiro derivado dos dados da série temporal. Defina o início e o fim de uma oscilação individual como o tempo correspondente à meia amplitude da oscilação. Calcule a duração e a frequência de oscilações individuais para cada célula. Calcule o valor inverso do intervalo interspike (adequado para padrões regulares de atividade). Alternativamente, divida o número de oscilações pelo intervalo de tempo do registro (adequado para padrões de atividade irregular). Calcule o tempo ativo. Expresse o tempo ativo como a soma das durações e divida esse valor pelo intervalo de tempo. Alternativamente, multiplique a frequência e a duração que correspondem a uma oscilação.NOTA: A divisão da soma das durações pelo intervalo de tempo proporciona resultados robustos, mas tem baixa discriminação estatística à medida que um único ponto de dados por célula é obtido. Multiplicar a frequência e a duração de uma oscilação fornece uma resolução temporal oscilação-oscilação.

Representative Results

A injeção da solução agarose no ducto pancreático é o passo mais crítico na preparação da fatia de tecido do pâncreas. Uma injeção bem sucedida pode ser reconhecida por um clareamento do tecido do pâncreas, como visto no lado esquerdo da Figura 3A, enquanto uma parte incompletamente injetada do pâncreas é apresentada no lado direito da Figura 3A. As ilhotas de Langerhans podem ser reconhecidas a olho nu ou sob um estereótipo, e isso ajuda a cortar as partes apropriadas do pâncreas para posterior incorporação em blocos de ágarose (Figura 3B). Em uma fatia de tecido pancreático de rato recém-cortada, as ilhotas de Langerhans podem ser facilmente distinguidas do tecido excerrino circundante e mesenchyme como manchas brancas sob o estereoscópio (Figura 3C) ou como estruturas acastanhadas sob o microscópio de luz (Figura 3D). As fatias de tecido pancreático podem ser usadas para tipos distintos de experimentos por pelo menos 12 h após o corte. Além da avaliação morfológica bruta sob o estereóscópio, o microscópio leve e as respostas funcionais das células durante a imagem de cálcio, a viabilidade das fatias de tecido pancreático pode ser avaliada (Figura 4). Figura 4: Viabilidade das células dentro da fatia de tecido. A viabilidade das células foi determinada com o ensaio Live/Dead. As células vivas são manchadas por Calcein AM (mostrado em verde), enquanto as células mortas são manchadas com ethidium homodimer-1 (mostrado em vermelho). As linhas amarelas denotam a posição da seção transversal X-Y da pilha Z exibida na parte inferior e direita. A profundidade total da pilha Z é de 88 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para experimentos de imagem de cálcio, o indicador de cálcio fluorescente precisa penetrar através de algumas camadas de células. A Figura 5A apresenta o carregamento bem sucedido do corante indicador Ca2+ permeável celular na fatia de tecido pancreático na qual as células individuais de ilhotas e acinar podem ser reconhecidas. Em contraste, as fatias na Figura 5B-D não são ótimas devido à penetração mal sucedida do corante (Figura 5B), falta de células de ilhotas (Figura 5C) e muito tecido necrosado na superfície (Figura 5D). Essas fatias podem ser descartadas, verificadas para a presença de ilhotas adicionais que são cortadas ou manchadas melhor (ver Tabela 1 para solução de problemas) ou usadas para registrar as respostas de células exócrinas. Figura 5: Exemplos de preparações utilizáveis e inutilizáveis. (A) Um exemplo de uma preparação bem sucedida da fatia de tecido do pâncreas com células bem manchadas nas ilhotas de Langerhans, bem como células ductais e tecido acinar circundante. (B) Um exemplo de uma fatia de tecido mal manchada. (C) Exemplo de uma ilhota de Langerhans com descontinuações estruturais. (D) Um exemplo de uma ilhota de Langerhans contendo muitas células mortas e muitos detritos. A tabela de procura “glow-over, glow-under” à direita exibe 0 intensidade em verde e saturação em azul. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Os resultados representativos da imagem de cálcio utilizando o corante indicador Ca2+ permeável celular são mostrados na Figura 6. Na Figura 6A, é apresentada uma imagem de alta resolução de uma fatia de tecido pancreático, contendo uma ilhota de Langerhans, tecido acinar e um ducto pancreático. Para melhor distinção, a parte endócrina, exócrina e ductal da fatia de tecido pancreático apresentada na Figura 6A são coloridas na Figura 6B. O uso de estímulos apropriados pode discriminar funcionalmente entre diferentes células ilhotas, ou células ilhotas e não ilhotas51. As células beta normalmente responderão a uma estimulação de pulso quadrado por glicose com um aumento transitório no IC [Ca2+]seguido de oscilações rápidas de cálcio em um platô sustentado (Figura 6C, painel superior). Como todas as células beta são acopladas a um único, grande e funcional síntio, essas oscilações também são muito bem sincronizadas entre diferentes células por meio da propagação [Ca2+]ONDAS IC 32,34,52,53,54 (Figura 7C). Oscilações mais lentas [Ca2+]IC com um período de 5-15 minutos podem estar por trás das oscilações rápidas ou mesmo ser o tipo predominante de reponse55,56. O mesmo protocolo simples pode revelar outros tipos de respostas, especialmente na periferia das ilhotas (Figura 6C, painel inferior). Como essas células não são sincronizadas com células beta e respondem com oscilações mais rápidas e irregulares que já estão presentes em baixas condições de glicose ou com uma diminuição da atividade, tais respostas são altamente sugestivas de células não beta 21,32,57,58. No entanto, sua caracterização funcional definitiva requer protocolos mais complexos com etapas adicionais de estimulação ou abordagens alternativas, que são discutidas abaixo. As respostas típicas das células acinar e ductal são apresentadas na Figura 6D e Figura 6E, respectivamente. Consulte a literatura para obter mais detalhes sobre as células acinar e ductal 22,23,35. Figura 6: Resultados representativos da dinâmica do cálcio em tipos distintos de células pancreáticas. (A) Uma imagem de alta resolução de uma ilhota de Langerhans com tecido circundante. Barra de escala = 100 μm. (B) Delineamento de partes distintas do tecido pancreático com tecido acinar mostrado em amarelo, uma ilhota de Langerhans mostrada em vermelho, e um segmento da árvore ductal em azul. Barra de escala = 100 μm. (C) Traços típicos da dinâmica do cálcio em células beta e putativa não beta durante a estimulação com glicose de 12 mM; A glicose de 3 mM foi utilizada para condições não estimulantes. Protocolos que podem ser usados para discriminação mais específica de células não beta são descritos na seção de discussão. (D) Um traço típico da dinâmica do cálcio das células acinar estimulada por acetilcolina de 25 nM. (E) Um traço típico da dinâmica do cálcio das células ductais estimulada por ácido chenodeoxíclico de 1 mM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Após o sucesso da imagem de cálcio, os dados são primeiro exportados e corrigidos para branqueamento por uma combinação de um ajuste exponencial e linear, conforme descrito na seção de protocolo. Uma série temporal antes e depois da correção do branqueamento é apresentada na Figura 7A. A partir daí, podem ser analisados vários parâmetros na fase de ativação e desativação da resposta, bem como a fase do planalto. Um atraso no início do aumento do IC [Ca2+]após a estimulação pode ser medido como representado pelo atrasoA na Figura 7B e pela heterogeneidade em atrasos entre células individuais (atrasoA1). Os mesmos parâmetros (atrasoD e atrasoD1) podem ser usados para descrever a fase de desativação. Após o aumento transitório inicial [Ca2+]IC, a fase do planalto na maioria das células beta pancreáticas em uma ilhota é caracterizada por oscilações relativamente regulares de alta frequência [Ca2+]IC. A fase do planalto pode ser descrita analisando os parâmetros funcionais clássicos. A apresentação esquemática das oscilações de IC [Ca2+]duração, frequência e percentual de tempo ativo são apresentadas na Figura 7C. Na imagem de cálcio com taxas de aquisição superiores a 10 Hz, ondas de cálcio que se espalham repetidamente pela ilhota também podem ser reconhecidas claramente (Figura 7C). Figura 7: Análise dos dados da série temporal. (A) Correção dos dados da série temporal para fotobleaching. (B) Análise dos atrasos na ativação após a estimulação e à desativação após a cessação da estimulação com glicose de 12 mM. A duração da estimulação é denotada pela barra cinza clara e sombreada na imagem. (C) Análise de vários parâmetros da fase do planalto: I) Duração da oscilação determinada a meia altura, II) frequência de oscilações determinadas por intervalos inter-oscilação. III) tempo ativo como produto de frequência e duração das oscilações. I-IV) Atrasos entre oscilações em qualquer determinada onda de oscilações que se espalham pela ilhota de Langerhans determinada pelos atrasos (Δt) no tempo em que uma única célula atinge meia altura da oscilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Mesa 1. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

O método de fatia de tecido pancreático é um método experimental rápido para estudar a morfologia e fisiologia das partes endócrina e exócrina do pâncreas em uma preparação mais conservada, in situ. Muitas das vantagens já foram apontadas na Introdução. Vale ressaltar que, em geral (ou seja, não apenas para a imagem de cálcio), a abordagem fatia para estudar fisiologia pancreática economiza tempo porque não envolve um período de recuperação após o isolamento. Este último não é absolutamente necessário com todos os tipos de experimentos e usos de ilhotas isoladas de diferentes espécies, mas é tipicamente empregado para aumentar a pureza, restaurar a viabilidade e funcionalidade, e às vezes coletar ilhotas de vários doadores 59,60,61,62,63,64 . No entanto, no contexto da imagem de cálcio, as respostas das células beta têm sido encontradas dependendo da duração e condições da cultura, e esta é uma importante fonte de variação que deve ser levada em conta ao usar ilhotas isoladas15,65. O mesmo problema deve ser considerado para fatias de tecido se sua cultura de longo prazo se tornar uma opção amplamente utilizada no futuro22,36. O método de fatia de tecido também tem um alto rendimento e, portanto, potencialmente reduz o sofrimento animal e aumenta o poder estatístico. Além disso, como muitas fatias podem ser preparadas a partir de um único animal e porque as fatias sobrevivem por longos períodos, incluindo o mesmo animal ou mesmo a mesma ilhota tanto no experimental quanto nos grupos de controle torna-se viável.

Como a arquitetura original e as comunicações célula-células são preservadas, e por ser compatível com uma série de análises estruturais, eletrofisiológicas, métodos de imagem e ensaios de secreção hormonal, este método é especialmente útil para estudar funções pancreáticas que dependem de interações não perturbadas entre células individuais, por exemplo, sensibilidade a secretagogues, paracrinos e interações imunológicas entre diferentes tipos de células, padrões de atividade elétrica, propriedades da dinâmica do cálcio, e a secreção de diferentes hormônios. Para a imagem de cálcio especificamente, as principais vantagens do uso de fatias são a exposição do núcleo ilhota e a possibilidade de adquirir sinais de muitos tipos de células diferentes com alta resolução. Dependendo dos requisitos do experimento e da idade dos animais, a espessura pode ser variada, as fatias podem ser transfeccionadas ou obtidas de animais com repórteres geneticamente codificados. Conforme explicado em mais detalhes abaixo, as duas últimas abordagens também permitem identificação funcional específica e caracterização de respostas de células não beta 31,66. Além disso, ilhotas de partes bem definidas do órgão podem ser estudadas por diferenças de capacidade de resposta ou suscetibilidade à doença. Embora não exijam um período de incubação de recuperação, eles podem ser facilmente incubados com diferentes agentes farmacológicos, ácidos graxos, alta glicose e citocinas.

Mais importante, como a alta resolução é alcançável em combinação com resolução unicelular ou mesmo subcelular, a imagem de cálcio confocal em fatias é um dos métodos mais adequados para analisar ondas de cálcio, conectividade funcional e os diferentes papéis funcionais das células em partes distintas de uma ilhota54,67. Apesar de uma série de vantagens, a abordagem da fatia de tecido tem limitações importantes. Em primeiro lugar, ainda é pelo menos parcialmente disruptivo para a arquitetura ilhota e exócrina, especialmente na superfície cortada, e precauções, como baixa temperatura, troca frequente de soluções e manipulação suave e rápida, são necessárias durante a preparação para evitar danos mecânicos e enzimáticos adicionais. Em segundo lugar, os padrões de distribuição de nutrientes e de nutrição ainda são inferiores à rota in vivo, a preparação é desvinculada da inervação sistêmica, e o feedback inter-órgão, como entre a ilhota e seus tecidos alvo, é impossível, em contraste com abordagens in vivo. Em terceiro lugar, a espessura máxima da fatia é limitada pela oxigenação, entrega de nutrientes e regulação do pH a ~200 μm9. Além disso, tanto a preparação de fatias quanto a imagem precisam de muito treinamento, e análises aprofundadas de dados de cálcio de séries de longa data e de muitas células requerem conhecimento especializado que muitas vezes não está incluído no kit de ferramentas de um fisiologista clássico e requer ajuda de físicos ou cientistas de dados. A vantagem de que as interações homo-e heterotípicas são preservadas também pode complicar a análise das amostras devido à presença de sinais de outras células em regiões de interesse. Dependendo dos protocolos, a ativação de outras células pode levar a estimulação adicional indireta ou inibição de uma célula observada.

Isso só pode ser resolvido conclusivamente por abordagens de desconvolução, por protocolos de estimulação mais complexos, incluindo substâncias que bloqueiam alguns dos efeitos indiretos, utilizando animais de knock-out específicos, e por comparação cuidadosa de resultados com resultados de outros estudos que empregam metodologias mais reducionistas. Além disso, se as medidas de secreção forem necessárias, deve-se ter em mente que algumas fatias podem não ter ilhotas, e a massa total de tecido endócrino em uma única fatia é tipicamente baixa. A preparação de fatias agudas de tecido pancreático para imagem envolve várias etapas críticas discutidas nas seções a seguir e resumidas na Tabela 1, onde o leitor também pode encontrar dicas curtas, mas importantes para a solução de problemas. Primeiro, ao preparar a solução agarose, o pó de agarose deve dissolver-se completamente, caso contrário as partículas não resolvidas podem obstruir a injeção. Mantenha a solução homogênea agarose a 37-45 °C para evitar o endurecimento da agarose devido a uma temperatura muito baixa por um lado e para evitar danos teciduais devido a temperaturas muito altas, por outro lado. Após o uso, a restante da agarose pode ser armazenada a 4 °C e reaquecida, embora o reaquecimento repetido possa resultar em aumento da densidade devido à evaporação da água, tornando a injeção difícil ou impossível.

O próximo passo crítico na preparação é fixar corretamente a papila duodenal principal. Uma mancha branca no duodeno indica a junção do ducto biliar comum e do duodeno. Um grampo colocado proximicamente resultará na obstrução de alguns ramos pancreáticos laterais do duto comum, desativando a injeção dessas partes, enquanto um grampo colocado muito distralmente resultará em vazamento de ágarose através do caminho de resistência inferior diretamente para o duodeno. Antes da canulação do ducto biliar comum, o tecido adiposo circundante pode ser cuidadosamente removido para melhor visualização do duto e maior controle durante a injeção. A precisão insuficiente durante a remoção do tecido circundante pode resultar em perfuração do duto. A seleção do diâmetro da agulha usada para a injeção de agarose também é importante. Em camundongos, uma agulha de 30 G é de preferência usada; agulhas menores (32 ou 33 G) requerem mais esforço devido à alta viscosidade da solução agarose e são mais propensas à obstrução. No entanto, se usados em combinação com uma solução de agarose de menor densidade, eles podem ser muito úteis em cepas de camundongos menores e animais mais jovens. Durante os dias pós-natal iniciais, a agarose pode, alternativamente, ser injetada subcapsularmente em vez de intradutalmente2. O uso de agulhas com maior diâmetro em camundongos provavelmente resultará em danificar o ducto biliar comum. Isso também pode acontecer com o diâmetro correto da agulha, e um fórceps pode ajudar a manter a agulha no lugar durante a injeção. Agulhas de diâmetro maior podem ser a única solução no caso de dutos maiores, como encontrado em ratos. Se a agulha estiver muito estreita para garantir uma vedação apertada prevenindo o vazamento de costas, uma ligadura pode ser colocada ao seu redor após a entrada bem sucedida no duto.

A injeção de Agarose requer algum esforço devido à viscosidade da solução, e uma vez que o processo de injeção tenha começado, ela não deve ser interrompida, pois a solução de agarose de ponto de fusão baixo pode se solidificar na agulha ou nas maiores partes da árvore ductal antes que a injeção seja concluída. Isso resultará em má penetração tecidual e pior suporte durante o corte. O duto deve ser sempre cânulado no ponto onde o ducto hepático esquerdo e o ducto cístico se unem para formar o ducto biliar comum.. Se o ducto biliar comum for perfurado, tente repetidamente cânulando mais perto do duodeno. Quando o pâncreas é suficientemente estabilizado com solução de agarose e extraído da cavidade peritoneal, pequenos pedaços de tecido bem injetado são cortados. Antes de incorporá-los à agarose, é crucial remover todos os tecidos adiposos e conjuntivos, pois seus resíduos tornam o corte mais desafiador. O mesmo se aplica aos vasos sanguíneos e resíduos de dutos, exceto quando eles são o foco do experimento. Neste caso, certifique-se de posicioná-los de tal forma que a seção transversal desejada será obtida. Ao incorporar o tecido em agarose, certifique-se de que a temperatura é apropriada (37 °C), e que o tecido esteja completamente cercado por agarose, pois forças durante o corte de vibratome podem arrancar o tecido do pâncreas dos blocos de agarose.

Secar rapidamente os blocos de tecido antes de colocá-los em agarose, colocando-os brevemente em um tecido de papel pode ajudar a evitar o mau contato entre tecido e agarose durante esta etapa. Durante a solidificação dos blocos de agarose, coloque a placa de Petri horizontalmente, e evite o contato entre o tecido do pâncreas e o fundo da placa de Petri. Se o pâncreas não for totalmente injetado, o processo de corte será desafiador. Portanto, tente reduzir a velocidade de corte para obter fatias de tecido. Para minimizar os danos celulares durante o corte de vibratome, substitua o ECS (e os cubos de gelo feitos de ECS) na câmara de corte regularmente. Esta última reduzirá a atividade de enzimas pancreáticas liberadas do tecido acinar durante o corte. A espessura das fatias também é de importância crucial. Para a dinâmica do cálcio e experimentos eletrofisiológicos, as fatias de 140 μm geralmente são cortadas; no entanto, de acordo com o objetivo do estudo, a espessura da fatia pode variar de 90 μm a 200 μm. Tenha em mente que em fatias mais grossas, a difusão de oxigênio e nutrientes será limitada, mas eles incluirão mais tecido. Além disso, espera-se que a proporção de ilhotas não cortadas aumente com o aumento da espessura das fatias. As fatias podem ser armazenadas em um ECS regularmente trocado à temperatura ambiente por várias horas ou até mesmo cultivadas em um meio celular apropriado por vários dias; no entanto, isso pode eventualmente afetar a fisiologia celular normalda ilhota 3,22.

Ao preparar a solução de corante, certifique-se de uma mistura cuidadosa de todos os componentes e evite a exposição à luz ambiente. A fatia pancreática é composta de muitas camadas celulares, e a absorção de corante de cálcio é limitada às primeiras camadas celulares mais superficiais, como descrito anteriormente para ilhotas isoladas58,68, e fatias pituitárias69. No entanto, em contraste com ilhotas isoladas onde a cápsula circundante e as camadas celulares externas dificultam a penetração do corante em camadas mais profundas, as fatias de tecido permitem o acesso a toda a superfície transversal da ilhota, permitindo a medição simultânea da dinâmica do cálcio em centenas de células de todas as camadas de uma ilhota. Os indicadores fluorescentes Ca2+ são os mais utilizados para medir a dinâmica do cálcio, e juntamente com o CLSM, permitem gravações com alta resolução temporal, atingindo várias centenas de Hertz. Ao selecionar o indicador fluorescente ca2+, considere diferentes fatores, incluindo a forma indicadora, que influencia o método de carregamento celular, o modo de medição (qualitativo ou quantitativo), e a constante de dissociação (Kd) que precisa estar na faixa de concentração ca2+ de interesse e depende de pH, temperatura, presença de Mg2+ e outros íons, bem como a ligação de proteínas. Como os sinais de Ca2+ celulares geralmente são transitórios, a constante de taxa de ligação Ca2+ também deve ser considerada. Para medir a dinâmica [Ca2+]IC em células pancreáticas, esse grupo utiliza principalmente o corante indicador Ca2+ permeável celular descrito neste protocolo (Tabela de Materiais), pois é um indicador de comprimento de onda longo com os comprimentos de onda de emissão no espectro onde a autofluorescência celular é geralmente menos problemática, e a energia da luz de excitação é baixa, o que reduz o potencial de fotodamagem celular. Como este corante é fluorescente em baixas concentrações ca2+, isso facilita a determinação da linha de base [Ca2+]IC e aumenta a visibilidade celular antes da estimulação. Após a ligação de Ca2+, a intensidade de fluorescência do corante aumenta 14 vezes, permitindo a detecção de mesmo pequenas alterações no IC [Ca2+].

Para uma imagem de cálcio com células vivas bem sucedidas, vários parâmetros cruciais de hardware precisam ser considerados, conforme descrito na seção de protocolo. Para imagens de células vivas, onde as amplitudes de sinal são baixas e as chances de fototoxicidade são altas, os objetivos com uma NA mais alta são de preferência usados para coletar mais luz do espécime. Se a dinâmica do cálcio deve ser registrada com uma alta resolução temporal, use o scanner ressonante em vez de galvanizômetros lineares. Além de escolher o objetivo certo, o uso de detectores altamente sensíveis – como detectores híbridos que requerem menos energia a laser evita fototoxicidade e fotobleaching. Isso é de especial importância para imagens de cálcio de longa duração. Outros passos importantes na imagem de cálcio são as configurações de parâmetros de qualidade de imagem para aquisições em séries temporizais. O mais importante é o temporal e a resolução espacial. Como a dinâmica do cálcio em si determina a menor resolução temporal aceitável, a taxa de amostragem precisa ser pelo menos duas vezes maior do que a frequência de sinal esperada para detectar o sinal ou até mesmo 10 vezes maior para detectar a forma do sinal de forma confiável. Em fatias agudas de tecido pancreático, a dinâmica do cálcio pode ser medida em centenas de células simultaneamente e, portanto, a resolução espacial também é importante. Isso pode ser melhorado aumentando o número de pixels ou aumentando a média da linha durante a aquisição ao vivo. No entanto, devido à relação inversa entre o espaço e a resolução temporal, é necessária uma troca entre ambas as configurações.

Se a imagem de cálcio tiver que ser realizada em uma população celular específica dentro do pâncreas, é necessário um estímulo capaz de diferenciar funcionalmente as células dentro da fatia. A alta glicose ativa as células beta de forma confiável e rápida para um padrão oscilatório que é sobreposto a um nível elevado de cálcio e é altamente sincronizado entre todas as células dentro de umailhota 32,58,70. As células beta são o tipo de célula mais numerosa dentro de uma ilhota e estão localizadas principalmente no núcleo da ilhota em camundongos. O mesmo protocolo de estimulação diminui e, às vezes, não altera consideravelmente o estouro em células alfa 30,32,58,70,71,72. Para discriminar as células alfa funcionalmente, a baixa (3 mM) glicose, glutamato ou adrenalina podem ser usadas para aumentar sua frequência ou basal [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. Eles representam 10-20% das células ilhotas e serão detectados na periferia da ilhota1. Células delta também são encontradas na periferia. Eles compõem apenas ~5% do número total de células endócrinas em uma ilhota e são tipicamente ativos em glicose de 6 mM e respondem à estimulação de glicose com uma atividade de estouro irregular aumentada da linha de base ou um nível de cálcio ligeiramente elevado 1,32,71,76. A grelina pode ser usada para estimulação específica de células delta 21,77,78,79 em experimentos de imagem de cálcio. No entanto, ainda estão a ser definidos protocolos para identificação funcional específica de células PP e epsilon. Além disso, 25 nM acetilcolina ativa de forma confiável as células acinar em atividade de estouro 35,80,81. Além disso, uma série de outras secretagogues, como ceruleina, colecistocina e carbamylcolina, podem ser usadas para evocar respostas de cálcio em células acinar 22,40,82,83.

Finalmente, 1 mM ácido chenodeoxíclico evoca de forma confiável as respostas de cálcio em células ductais em fatias de tecido; angiotensin II, ATP e alguns outros secretagogues também podem ser usados 11,23,84,85. Sempre que uma identificação funcional baseada em respostas características a secretagogues e inibidores específicos não é suficiente, animais geneticamente rotulados31, células transfeinadas73 ou imunocytoquímica podem ser empregados para a identificação de diferentes tipos celulares 9,22,71,86 . Nos últimos dois anos, o método de fatia de tecido foi adaptado com sucesso ao tecido humano, abrindo muitas novas importantes vias de pesquisa tanto na exocrina41 quanto na fisiologia endócrina 9,36,37,39. Curiosamente, uma avaliação detalhada da dinâmica do cálcio nas ilhotas humanas tem sido notoriamente difícil e continua a ser investigada com maior detalhe87. Combinado com a microscopia confocal avançada, o método de fatia de tecido pancreático permitiu muitas novas percepções sobre a dinâmica do cálcio em camundongos e, esperançosamente, fará o mesmo para o tecido humano.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho apresentado neste estudo foi apoiado financeiramente pela Agência de Pesquisa eslovena (núcleo de pesquisa nos. P3-0396 e I0-0029, bem como projetos de pesquisa nos. J3-9289, N3-0048 e N3-0133) e pelo Fundo austríaco de Ciência / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bolsas bilaterais I3562-B27 e I4319-B30). Agradecemos a Maruša Rošer, Maša Čater e Rudi Mlakar pela excelente assistência técnica.

Materials

Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 – Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors – ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS – 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate – CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride – KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate – NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride – NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide – NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).
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