急性小鼠胰腺组织切片钙动力学的共聚焦激光扫描显微镜

注意：所有实验均严格按照研究中护理和使用动物的机构指南进行。该协议由斯洛文尼亚共和国食品安全，兽医部门和植物保护管理局批准（许可证号：34401-35-2018 / 2）。 1. 胰腺组织切片的制备 注意：使用CLSM制备用于钙成像的急性小鼠胰腺组织切片需要许多仪器，不同的解决方案，并按照一系列关键步骤进行，这些步骤在 图1 中示意性地呈现并在下面详细描述。 图 1：工作流程图。 胰腺组织切片制备过程中所有步骤的示意图，从将琼脂糖注射到胆总管开始，然后提取胰腺和切片。制备的切片可用于用活/死试剂盒评估组织的活力或用钙传感器染色。一旦染色，它们就可以进行成像了。然后，从成像过程中获得的记录将用于数据分析。 请点击此处查看此图的大图。 溶液的制备注意：所有溶液都应提前准备好，并且可以在4-8°C的冰箱中储存长达一个月。为了制备和储存组织切片，需要约0.5L含有6mM葡萄糖的细胞外溶液（ECS）和0.3L的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）缓冲液。对于以1-2 mL / min流速设置的灌注系统进行1天的钙成像，需要约0.5 L的ECS。 含有6 mM葡萄糖的细胞外溶液 制备1升ECS，其中含有125 mM NaCl，26 mM NaHCO3，6 mM葡萄糖，6 mM乳酸，3 mM肌醇，2.5 mM KCl，2 mM丙酮酸钠，2 mM CaCl2，1.25 mM NaH2PO4，1 mM MgCl2和0.5 mM抗坏血酸。彻底混合，直到所有成分完全溶解。将50μLECS放入0.5mL微量离心管中，根据制造商的说明将其置于渗透压计上，并检查渗透压。注意：渗透压应为 300-320 mOsm。为了刺激β细胞，使用葡萄糖浓度较高的溶液。为了在切片和实验过程中确保生理pH值为7.4，在气压下用碳原（即95%O2 和5%CO2的气体混合物）不断鼓泡ECS。通过将5毫米硅管的一端连接到碳原源（即加压气瓶），并将管子的另一端直接放入装有ECS的瓶子中，可以设置简单的鼓泡系统。 或者，制备含有1250 mM NaCl，260 mM NaHCO3，30 mM肌醇，25 mM KCl，20 mM丙酮酸Na，12.5 mM NaH2PO4和5 mM抗坏血酸的10x储备液。当需要含有6 mM葡萄糖的ECS时，将100 mL储备液与2 mL 1 M CaCl2，1 mL 1 M MgCl2，0.455 mL 13.2 M乳酸和1.08 g葡萄糖混合，并填充双蒸馏水至1 L。如果需要，使用不同量的葡萄糖来获得其他葡萄糖浓度。 含 6 mM 葡萄糖的 HEPES 缓冲液 制备0.5升含有150mM NaCl，10mM HEPES，6 mM葡萄糖，5 mM KCl，2 mM CaCl 2和1 mM MgCl2的HEPES缓冲溶液（HBS）;滴定至pH = 7.4，含1 M NaOH。注意：如果碳原不可用，则可以将此缓冲液用于所有步骤，而不是 ECS。 琼脂糖（1.9%w/w） 将水浴预热至40°C。 将0.475克低熔点琼脂糖和25毫升含有6 mM葡萄糖的ECS加入锥形瓶中，并将烧瓶以最大功率放入微波炉中几秒钟，直到它开始沸腾。将烧瓶从烤箱中取出并旋转几次，直到琼脂糖完全溶解。将装有液体琼脂糖的烧瓶转移到40°C的预热水浴中，将琼脂糖冷却到所需温度并保持液态直到注射。用稳定引线环固定烧瓶。注意：琼脂糖可以提前准备并保存在冰箱中。使用前，在微波炉中加热琼脂糖直至液化，并将锥形瓶转移到预热至40°C的水浴中。 琼脂糖可以重复使用多达5倍。如果重复使用超过5倍，它将变得密集且难以注射。 用琼脂糖注射胰腺注：第1.2和1.3节解释了可用于不同实验目的的组织切片的制备，例如钙成像，电生理学，免疫组织化学，分泌研究和结构/微观解剖学研究。在步骤1.1.3.2的水浴中，用锥形瓶中的液体琼脂糖填充5 mL注射器，除去任何气泡，然后安装30G针头。用盖子保护针头，并将填充的注射器保持在水浴中，针头朝下，整个琼脂糖体积低于水面。用稳定铅环固定注射器，使环将注射器压在水浴池的壁上。注意：注意不要将任何琼脂糖推入针头中，因为它会迅速变硬并堵塞针头。如果室温较低，并且如果注射由经验不足的人进行，请将水浴的温度提高到42°C，以获得一些额外的注射时间。 在冰桶中装满冰块，然后将装有 ECS 的瓶子放入其中。在气压和室温下以1.5 mL / min的速度用碳原不断冒泡ECS，以确保氧合和7.4的pH值。 通过施用高浓度的CO2 然后宫颈脱位来处死小鼠。尽一切努力减少动物的痛苦。 在立体显微镜下工作，通过剖腹手术进入腹部（图2A）。轻轻地将肠道翻转到小鼠的左侧（从小鼠的解剖学角度）以暴露胆总管。使用镊子稍微抬起十二指肠部分，并找到Vater的主要十二指肠-。使用止血剂（图2B，C）将胆总管夹在十二指肠处，以防止琼脂糖从胆管渗漏到十二指肠中。注意：为了防止琼脂糖渗漏到十二指肠中并在胃肠道中进一步上下，将止血剂置于其近端和远端与的紧端和远端夹住十二指肠的方式。为此，最好使用弯曲的止血剂。 用小的尖锐镊子，到达胆总管下方，并打破将胆管连接到胰腺组织的膜。为了更好的视觉控制和更容易注射，从导管中清除尽可能多的脂肪和结缔组织。 将胆管垂直于大镊子上（图2D），并将制备的液体琼脂糖注射到胆总管的近端部分（图2D）。一定要用力挤压注射器，因为琼脂糖是粘稠的。继续填充胰腺，直到它变白并略微膨胀或至少20-30秒。注意：这是切片制备中最关键的步骤。如果胰腺导管树有任何扭结，请轻轻抬高胰腺或将胰腺从注射器中拉出以使其水平。不要根据注射器注射的体积决定何时停止注射，因为注射点的回流和向前渗漏到十二指肠的体积通常远高于注射到胰腺导管树中的体积。重要的是，成功的注射可以在注射器体积几乎不明显变化的情况下进行。 取出注射器，并在0-4°C下将20mL起泡的冰冷ECS从瓶子上倒入胰腺上以冷却组织并使琼脂糖变硬。 使用镊子和细小的坚韧剪刀轻轻提取胰腺。将提取的胰腺放入含有约40 mL冰冷ECS的100 mm培养皿中，然后轻轻移动以清洗。将胰腺转移到含有约40毫升冰冷ECS的新鲜100毫米培养皿中。 从看起来发白的胰腺注射良好的部分（图3A），使用镊子和坚韧的剪刀切割多达6块组织，大小为0.1-0.2 cm3 。清除它们的任何结缔组织和脂肪组织。 在40°C下用约5mL液体琼脂糖填充35mm不粘的底部培养皿，将组织块转移到其中，并立即将培养皿放在冰上以冷却并硬化琼脂糖。注意：胰腺块被困在琼脂糖中的方式决定了它们在切片过程中的切割方式。经验丰富的实验者可以尝试在琼脂糖在冰上变硬之前的几分钟内微调块的位置。 在带有组织块的琼脂糖变硬后，将培养皿倒置到平坦光滑的表面上，例如100mm培养皿的盖子，并通过用剃须刀片的一半轻轻切入培养皿的侧壁和琼脂糖之间的边缘来除去琼脂糖。用剃须刀片切割单独的琼脂糖块，每个琼脂糖块包含一个组织块，注意每个组织块被琼脂糖包围。用氰基丙烯酸酯胶将琼脂糖块粘在振动切片机的样品板上（图3B）。 图2：将琼脂糖注射到胆总管 中。（A）打开腹腔，露出腹腔内的器官。（B） 面板 A 中矩形所包围区域的放大部分。十二指肠上的白点（由箭头表示）表示Vater的壶腹。朗格汉斯的小岛用箭头表示。（C）用弯曲的止血器夹住Vater的壶腹，并稍微抬起以暴露并轻轻拉伸胆总管（箭头）。（D）使用5mL注射器和30G针头对胆总管进行插管和注射1.9%琼脂糖溶液。 请点击此处查看此图的大图。 切片 用〜0.15 L冰冷的ECS填充振动切片机的切割室，并用碳原不断起泡。用冰包围切割室，并将2个由ECS制成的具有6 mM葡萄糖的冰块（每个约10 mL）加入切割室。将用于切割的剃须刀片安装到振动筛上，并用琼脂糖块将样品板拧紧到位。 设置切片机，以0.05至1 mm / s和70 Hz的速度将琼脂糖块切割成表面积为20-100 mm2的140μm厚的切片。对于切片器设置，请按照制造商的说明进行操作。 在每个切割步骤之后，立即暂停切片机，用细油漆刷轻轻收集切片，并将它们转移到100mm培养皿中，其中装有40mL HEPES缓冲液，室温下6mM葡萄糖（图3C）。注意：切片可以在室温下在HEPES缓冲液中保存至少12小时，缓冲液应每2小时更换一次。 图3：胰腺组织制备和切片（A）琼脂糖注射后提取的小鼠胰腺。左侧的白色组织表示注射良好的部分（十二指肠部分），而右侧较红的部分表示胰腺注射不足的部分（脾部）。（B）将两块胰腺组织嵌入琼脂糖的振动切片。（C）急性胰腺组织切片，带有由箭头表示的朗格汉斯胰岛。（D）在光学显微镜下切开急性胰腺组织切片，用箭头表示朗格汉斯胰岛，星号表示胰管。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。 2. 使用活/死活力/细胞毒性试剂盒对哺乳动物细胞进行活/死测定 注意：对于某些实验，通过活/死测定检查切片中细胞的活力（图4）是有用的，如下所示。 按照制造商的说明，用活/死活力/细胞毒性试剂盒的试剂解冻小瓶，并在使用前准备钙黄绿素AM的工作溶液。在一天内使用解决方案。 在15 mL离心管中，混合5μL4mM钙黄绿素AM（组分A），20μL2mM乙锭同源二聚体-1（EthD-1，组分B）和10mLDulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），以制备含有约2μM钙黄绿素AM和4μM EthD-1的工作溶液。彻底涡旋。 使用细油漆刷，将组织切片轻轻转移到带有新鲜HEPES缓冲液的3mL培养皿中，以稀释血清酯酶活性。取出HEPES缓冲液，并用步骤2.2中的工作溶液的100-200μL（或更多，如有必要）覆盖切片。 将切片在室温下在封闭的培养皿中孵育30-45分钟。根据制造商的建议，使用激发/发射滤光片对组织切片进行成像。 3. 钙染料上样 注意：在染料的制备和上样过程中，以及在处理染色组织切片的过程中，荧光染料应避免光照。锡箔可用于覆盖含有钙染料的管子或培养皿。 染料制备 溶解一小瓶（50μg）细胞渗透性Ca2 + 指示染料（激发/发射495/523nm;见 材料表），7.5μL二甲基亚砜（DMSO）和2.5μLpolaxamer（DMSO中的20%溶液; 材料表）在15 mL螺旋盖管中含有6 mM葡萄糖的6.667 mL HBS中。注意：该最终溶液含有6μM的Ca2 + 指示染料，0.11%DMSO和0.037%的polaxamer。 用移液管在螺旋盖管中反复吸出并排出溶液20秒;将管子浸入超声波浴室中30秒，涡旋30秒以改善增溶性。将步骤3.1.1制备的最终Ca2+ 指示染料溶液的3.333mL等分试样放入5mL培养皿中。 染料装载 通过使用薄而柔软的油漆刷轻轻提起每个组织切片并将其置于染料溶液中，将制备的组织切片从带有HBS的60mL培养皿转移到装有染料溶液的5mL培养皿中。每个培养皿孵育多达10片组织切片。 将切片加载的培养皿置于室温下的轨道振荡器上，设置为每分钟40圈的轨道运动50分钟。在室温下暴露于环境空气的染料溶液中孵育切片，但通过用锡箔覆盖培养皿来屏蔽光线。 切片的存储 使用细软的油漆刷轻轻提起，将5 mL培养皿中的染色组织切片转移到装有无染料HBS的60 mL培养皿中。每个培养皿最多可储存20片。注意：此时使用组织切片进行成像。组织切片将保留Ca2 + 指示染料数小时。通过将培养皿置于被冰包围的绝缘容器中，可以提高切片的存活率和染料的保留率。如果要运输装载染料的切片，这一点尤其重要。此外，每2小时更换一次HBS。 4. 钙成像 共聚焦显微镜的设置 根据研究的兴趣选择合适的物镜放大倍率。选择 20x 和 25x（数值孔径 [NA] 0.77-1.00）来可视化整个小岛、同时显示多个 acini 或更大的管道。选择更高的放大倍率来研究细胞内动力学。 选择延时成像的采集模式（例如， 延时、xyt 或类似模式）。将针孔设置为100-200μm。 设置绿色荧光基团的光路：在488nm处激发，在500-700nm处收集发射。优选选择具有高量子效率的探测器（例如，砷化镓磷化物）而不是光电倍增管探测器。 设置记录室和灌注系统 将记录室安装在显微镜和灌注系统的温度控制台上（重力进给或基于蠕动泵的设置，体积1 mL）。将入口和出口放置在记录室的远端边缘，以避免灌注液在腔内蜿蜒，并将流入和流出设置为相等的值（1-2 mL / min）。避免液体半月板高度和液滴在腹膜中的漂移。 将灌注系统的温度控制设置为37°C，用非刺激性溶液开始灌注，并制备刺激溶液。通过电动阀或手动切换为灌注系统供料的溶液来改变溶液。 记录钙动力学 将单个组织切片转移到记录室中。用U形铂砝码和绷紧尼龙网固定纸巾片（例如，从尼龙长筒袜）。避免将尼龙线定位在感兴趣的结构上。 使用明场选项定位胰岛/导管/导管。运行实时成像以将研究的结构定位到视野中，并设置成像参数。通过调整激光功率、检测器放大和线平均/分档来优化信噪比，从而实现单元的可视化，同时保持最小的激光功率。 将记录的焦平面调整到切割表面以下约15μm（图5），以避免记录切割表面可能受损的细胞。 获取图像。将采样频率设置为1-2 Hz以最初检测单个振荡，并使用能够以更高的采集速率（>10 Hz）进行快速线平均（8-20）的共振扫描仪来记录细胞内Ca2 + （[Ca2 + ]IC）活性。在连续的点照明之间留出一个间隔（例如，总采样时间的30%），以防止光毒性。在时间序列采集之前记录高分辨率图像（例如，1024 x 1024像素，线均>50）（参见第5节）。注意：对于大多数电池，1-2 Hz的采样频率低于奈奎斯特的采集频率标准，默认情况下，信号的形状将被欠采样。 请参阅在线图表（如果成像软件中提供），以获取有关制备响应、过度照明、光漂白和机械漂移的即时反馈。如果在采集过程中漂白率很高，请停止记录并降低激光功率，同时增加检测器增益以保持信噪比。在机械漂移的情况下，检查管道/电缆与显微镜载物台之间的张力以及液体泄漏或记录室中体积的变化。（可选）尝试手动校正采集过程中的漂移;但是，请注意，这本质上会产生有限的结果。注意：内分泌细胞在接近阈值的浓度下是高度异质的。需要足够长的刺激来检测单个细胞中的活化/失活延迟范围。这对于准确检测高度刺激方案后的不良反应尤为重要。 使用钙成像在功能上区分内分泌细胞和外分泌细胞（图6）。要记录激活和停用期间的瞬态活动，请在不停止记录的情况下应用刺激。 实验结束后保存数据（考虑使用自动保存功能）。在关闭激光电源之前，请留出一段时间的冷却时间，以免在关断过程中损坏激光器。 5. 数据分析 通过重放延时视频，目视检查录制内容。检查来自视场或光学平面的电池漂移。如果光学平面内发生漂移，请使用ImageJ中的漂移校正插件。 使用显微镜软件或第三方软件选择感兴趣的区域（ROI）。使用高分辨率图像、最大投影或帧平均值作为选择 ROI 的参考。重放延时成像以可视化在参考图像中不可见的反应细胞。定位投资回报率，使ROI的选定区域不与相邻单元重叠，以避免ROI之间的信号串扰。 将时间序列数据导出为每帧的 ROI 平均值。导出 ROI 坐标。 通过采用指数和线性拟合的组合来校正漂白的时间序列数据（图7A），如(1)其中 x（t） 表示时间点 t 处的荧光信号; xcorr（t） 在相应时间点的校正信号;和 a、 b 和 c 的拟合参数计算为 corr（t） 和 x（t） 之间的最小平方和。 分析响应的激活和停用阶段（图7B）。计算时间序列数据的一阶导数，并分别确定激活和失活对应的导数的天顶和最低点。或者，手动选择相位增加的开始时间。保存并导出激活/停用时间和相应的单元格坐标。 分析平台期（图7C）。通过对原始数据进行阈值或对时间序列数据的一阶导数进行阈值来检测单个振荡。将单个振荡的开始和结束定义为与振荡的半振幅相对应的时间。 计算每个单元的持续时间和单个振荡的频率。计算尖峰间间隔的反比值（适用于常规活动模式）。或者，将振荡次数除以记录的时间间隔（适用于不规则活动模式）。 计算活动时间。将活动时间表示为持续时间的总和，并将此值除以时间间隔。或者，将与振荡相对应的频率和持续时间相乘。注意：将持续时间的总和除以时间间隔可提供可靠的结果，但由于每个像元获得单个数据点，因此统计鉴别率较低。将振荡的频率和持续时间相乘可提供振荡到振荡的时间分辨率。