颗粒模板化乳化可实现无微流体液滴检测

1.制备用于颗粒模板化乳化的水凝胶颗粒。 用于颗粒模板化乳化的水凝胶颗粒可以使用两种不同的方法制备。 使用市售颗粒进行制备 将0.5克与PTE兼容的干燥聚丙烯酰胺颗粒（例如，Bio-Gel P-60凝胶（Bio-Rad），直径45-90μm）加入30mL无菌水中，在50 mL锥形管中混合均匀。在室温下孵育30分钟。 使用微流体制备颗粒的制备方法注意：与PTE兼容的聚丙烯酰胺颗粒可以使用市售的液滴制造商（例如，QX200液滴发生器（Bio-Rad），RayDrop（Fluigent）等）或通过定制的微流体设计来制备。定制母版的制作 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计软光刻掩模。在电路板胶片上以10μm分辨率打印光掩模。 将 1 mL 光刻胶倒入 3 英寸硅晶圆的中心。使用旋转涂布机以500 rpm旋转30秒，然后以1250 rpm旋转30秒，从而形成50μm的光刻胶层。将晶圆放在设置为95°C的加热板上15分钟以蒸发溶剂。 用盖玻片将光掩模固定在硅晶圆上，并将晶圆暴露在准直的190 mW，365μm UV LED下2.5分钟。将威化片放在设置为95°C的加热板上5分钟，以进行曝光后烘烤。 通过将光刻胶硅片浸入100%丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）浴中长达15分钟来开发光刻胶硅片。用新鲜的100%PGMEA冲洗晶圆，然后用100%异丙醇冲洗晶圆。风干晶圆。 通过将晶圆在设置为95°C的加热板上干燥1分钟来除去任何残留的异丙醇。将威化片放入培养皿中干净的3中。 定制微流体装置的制造 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅基和固化试剂以10：1的质量比混合。在室内真空下使用干燥器对混合的PDMS进行脱气，直到没有可观察到的气泡。 将脱气的PDMS倒在培养皿中的母杯上，确保硅晶圆完全浸没。对硅晶圆和PDMS进行脱气，以除去浇注过程中可能形成的任何气泡。 通过将硅晶圆和PDMS放入设置为65°C的烘箱中至少60分钟来固化PDMS。使用手术刀从培养皿中切除含有微流体特征的PDMS块。格外小心，以避免损坏芯片主站上存在的任何功能。 使用0.75 mm活检冲头将入口和出口打孔到与微流体装置中的入口和出口相对应的PDMS块中。通过重复应用去除任何灰尘和颗粒，并将包装胶带去除到PDMS块的表面。 清洁 50 mm x 75 mm 载玻片，方法是用 100% 异丙醇冲洗，然后风干表面。等离子体使用1 mbar的O2 等离子体处理载玻片和PDMS（朝上的特征），使用等离子体键合器1分钟。 通过将等离子体处理的PDMS与特征面朝下放置在载玻片上，等离子体处理的一面朝上，将PDMS贴在载玻片上。将载玻片放入设置为65°C的烤箱中至少30分钟以完成粘合。 用氟化表面处理处理所有微流体通道，以确保表面疏水性并防止润湿。将设备在65°C下烘烤至少10分钟。 模板粒子的制造 制备由6.2%丙烯酰胺，0.18%N，N′-亚甲基双（丙烯酰胺）和0.3%过硫酸铵组成的聚丙烯酰胺（PAA）溶液。将此溶液装入带有28G针头的1 mL注射器中。 在氢氟醚（HFE）油中制备由5%（w / w）氟表面活性剂和1%N，N，NN-四甲基乙二胺（TEMED）组成的不溶性连续相，用于产生和稳定液滴。将溶液装入新的1 mL注射器中。 将含有注射器的PAA和HFE溶液加载到注射器泵（例如，NE-501）中。使用插入注射器和设备的聚乙烯管将两个注射器连接到微流体装置。在连接之前，启动泵以从管道中除去空气。注：根据型号的不同，注射泵可通过内置输入、制造软件或自定义脚本（https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program 提供）进行控制。 使用 PAA 和 HFE 油输入分别以 300 μL/h 和 500 μL/h 的速度运行液滴发生装置。将1mL液滴收集在15mL收集管中，并在室温下孵育3小时以进行聚合。孵育后，通过移液除去下层油。 将 1 mL HFE 油中的 20% （v/v） 全氟-1-辛醇 （PFO） 加入 15 mL 收集管中作为化学破乳剂。混合后，以2000× g 离心15 mL收集管旋转2分钟。通过移液去除PFO/HFE上清液。重复1次。 将2 mL己烷中的2%脱水山梨糖醇单油酸酯加入15 mL收集管中并涡旋混合。以3000 x g 旋转管3分钟。通过移液除去表面上活性剂/己烷溶液来除去上清液。重复2次。 加入5 mL TEBST缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，274 mM NaCl，5.4 mM KCl，20 mM EDTA，0.2% Triton X-100）并充分混合。以 3，000 x g 的速度向下旋转 3 分钟。通过移液除去上清液。重复3次。 重悬于 5 mL TEBST 中。该溶液可以无限期地储存在4°C。 2.颗粒模板化乳化。 在制备模板颗粒之后，PTE用于将样品和试剂封装在液滴中。 通过以6000× g 离心1分钟以沉淀颗粒来制备用于颗粒模板化乳化的聚丙烯酰胺颗粒，然后通过移液除去上清液并使用无菌水重悬。重复3次以确保去除任何残留的TEBST。 使用血细胞计数器（或等效物）确定模板颗粒的浓度和直径。通过以像素为单位测量直径并转换为微米来计算单个颗粒直径。像素到微米的转换可以使用血细胞计数器（或等效物）作为校准载玻片进行计算，并以像素为单位测量已知的网格距离。 根据 表1，使用PCR预混液，适当的引物和荧光素水解探针在新鲜的1.5mL微量离心管中制备分散相。使用管旋转器在室温下在温和搅拌（10rpm）下孵育5分钟，以确保组件的均匀分布。注：颗粒的体积和目标浓度基于泊松载荷。作为一般规则，粒子的数量应该比要封装的样品数量多一个数量级。对于未知浓度的样品，需要稀释系列以确保泊松负载。 卷 试剂 100 μL 颗粒 （450 颗粒 / μL） 200 μL 2x PCR 预混液 18 μL 10 μM 正向底漆 18 μL 10 μM 反向引物 18 μL 10 μM 探头 0.8 μL 海卫一X100 45.2 μL 无核酸酶水 表 1.与PTE一起制备用于数字液滴PCR的PCR预混液。 以6000× g 离心分散相1分钟，并除去上清液。记录提取的上清液的体积，并使用以 2.3 计算的总分散相体积确定沉淀体积。注意：提取的上清液量将根据颗粒堆积，直径和浓度而变化，最小预期体积为300μL。 将1μL1.62pg / μL 酿酒酵母 基因组DNA从2.4加入沉淀中，并通过移液或剧烈敲击彻底混合。注：过量含水物的存在会降低封装效率。如果样品体积超过沉淀体积的1%，则浓缩样品。如果样品无法浓缩，请根据样品体积缩放PCR预混液和所得沉淀体积。PTE允许乳化小（10μL）至大体积（2 mL）的模板颗粒。PCR预混液（2.3）和油（2.6）可以分别根据颗粒的靶标（2.3）和测量（2.4）体积进行缩放。 将HFE油中的200μL 2%含氟表面活性剂作为不溶性连续相加入管中进行乳化。确保通过移液或轻拍/轻拂试管来排出沉淀。然后以3000 rpm的速度涡旋30秒。注：对应于 3000 rpm 的设置可能因品牌和型号而异。 让乳液沉降1分钟。除去100μL底油相，并用HFE油中的新鲜2%含氟表面活性剂代替该体积。轻轻翻转管子几次以混合。重复3-5次或直到小卫星液滴被移除。 3.数字液滴PCR和分析。 沉降2-5分钟后，除去底部油相。用氟碳油中的 5% 含氟表面活性剂（例如 FC-40）代替此体积。 使用宽孔移液器吸头，小心地将100 μL样品移入200 μL PCR管中。将PCR管放入热循环仪中，并按 表2运行。 步 温度 期间 笔记 1 95 °C 2 分钟 2 95 °C 30 秒 3 50 °C 90 秒 4 72 °C 60 秒 5 重复 x34 步骤 2 到 4 6 72 °C 2 分钟 7 2 °C 拿 表 2.使用PTE乳液的数字液滴PCR的热循环条件。 使用宽孔移液器吸头将样品移液到计数载玻片上，以进行荧光成像。使用具有490 nm激发和525 nm发射检测波长的荧光显微镜对样品进行成像。 量化阳性荧光液滴（Np）和总液滴（NT）以验证是否存在，并使用阳性液滴（Np / NT）的比例和泊松统计来计算模板分子（λ）的数量： 通过以下方式计算 95% 置信区间 （zc = 1.96）： 使用步骤 2.5中加入的样品的体积（ν，μL）计算样品浓度（分子/μL），使用下面给出的方程。使用技术重复确定样品浓度的平均值和标准偏差。