Aktivitet av bakre laterala linjen Afferent nervceller under simning i zebrafisk
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att övervaka förändringar i den afferenta neuron aktiviteten under motoriska kommandon i en modell ryggradsdjur hår cell system.
Abstract
Sensoriska system samlar ledtrådar som är nödvändiga för att styra beteendet, men djur måste dechiffrera vilken information som är biologiskt relevant. Rörelse genererar återafferenta signaler om att djur måste frigöra sig från relevanta sensoriska signaler i den omgivande miljön. Till exempel, när en fisk simmar, detekteras flöde som genereras från kroppsanfall av de mekanoreceptiva neuromasterna, bestående av hårceller, som komponerar sidolinjesystemet. Hårcellerna överför sedan flytande rörelseinformation från sensorn till hjärnan via de sensoriska afferenta nervcellerna. Samtidigt vidarebefordras corollary urladdning av motorkommandot till hårceller för att förhindra sensorisk överbelastning. Att redovisa den hämmande effekten av prediktiva motoriska signaler under rörelse är därför avgörande vid utvärdering av känsligheten hos sidoledningssystemet. Vi har utvecklat en in vivo elektrofysiologisk strategi för att samtidigt övervaka bakre laterala linjen afferent neuron och ventral motorrot verksamhet i zebrafisk larver (4-7 dagar efter befruktning) som kan pågå i flera timmar. Extracellulära inspelningar av afferenta nervceller uppnås med hjälp av den lösa patchklämman tekniken, som kan upptäcka aktivitet från enstaka eller flera nervceller. Ventrala rotinspelningar utförs genom huden med glaselektroder för att upptäcka motorisk neuronaktivitet. Vårt experimentella protokoll ger potential att övervaka endogena eller framkallade förändringar i sensorisk ingång över motoriska beteenden i ett intakt, beteende ryggradsdjur.
Introduction
Afferenta nervceller av mekanosensoriska system överför information från hårceller till hjärnan under hörsel och balans. Elektrofysiologi kan avslöja känsligheten hos afferenta nervceller genom direkta inspelningar. Medan hela cell patchning från hårceller kan vara utmanande, inspelning från nedströms afferenta nervceller är lättare och möjliggör bedömning av åtgärder potentialer som svar på kontrollerade stimuleringar1,2,3. Stimulerande hårceller leder till deras avböjning, vilket ändrar mekanosensoriska strukturer, vilket utlöser en ökning av åtgärdspotentialer (spikar) i afferenta nervceller4,5,6. I avsaknad av yttre stimuli spikar afferenta nervceller också spontant på grund av glutamatläckage från hårcellerna på till afferenta postsynaptiska terminaler7,8, och har visat sig bidra till att upprätthållakänslighet 9,10. Patchklämma inspelning av afferent aktivitet möjliggör observation av hårcellskänslighet och signaldynamik som inte är möjliga med hjälp av tekniker med lägre temporal upplösning, såsom i mikrofonik11,12 eller funktionell kalciumavbildning13,14,15. Följande protokoll gör det möjligt att registrera afferent aktivitet samtidigt med motorkommandon för att avslöja omedelbara förändringar i hårcellskänsligheten.
Zebrafisk (Danio rerio) använder hårceller som finns i neuromaster som komponerar sidolinjesystemet för att upptäcka vattenrörelser i förhållande till kroppen, vilket översätts till neurala signaler som är väsentliga förnavigering 16,17,18,rovdjursundvikande, bytefångst19,20ochskolgång 21. Vattenflödet kan också vara självgenererat av rörelserna i simning22,23,24,andning22,25,26och utfodring27. Dessa beteenden omfattar repetitiva rörelser som kan trötta ut hårceller och försämra avkänningen. Därför är det viktigt att sidolinjesystemet skiljer mellan yttre (exafferent) och självgenererade (reafferent) flödesstimulanser. En corollary urladdning dämpar självgenererade flöde signaler under rörelse i zebrafisk. Denna hämmande prediktiva motorsignal vidarebefordras via fallande nervceller till de sensoriska receptorerna för att modifiera ingången eller avbryta behandlingen av den återafferenta återkopplingen28,29. Seminalt arbete som bidrar till vår tidiga förståelse av detta feedforward-system förlitade sig på in vitro-preparat där anslutningen och endogen aktivitet hos neuralkretsen inte bibehölls28,30,31,32,33,34,35. Detta protokoll beskriver en metod för att bevara en intakt neural krets där endogen feedback dynamik upprätthålls, vilket möjliggör bättre förståelse för den corollary ansvarsfrihet in vivo.
Protokollet som beskrivs här beskriver hur man övervakar bakre laterala linjen afferent neuron och motor neuron verksamhet samtidigt i larv zebrafish. Karakteriserande afferent signaldynamik före, under och efter motoriska kommandon ger insikter i realtid, endogen feedback från centrala nervsystemet som modulerar hårcellskänslighet under rörelse. Detta protokoll beskriver vilka material som kommer att behöva förberedas före experiment och beskriver sedan hur man förlamar och förbereder zebrafisklarver. Protokollet kommer att beskriva hur man upprättar en stabil lös patch inspelning av afferenta nervceller och extracellulära ventrala rot (VR) inspelningar av motoriska nervceller. Representativa data som kan erhållas med hjälp av detta protokoll presenteras från en exemplarisk individ och analys utfördes på flera replikat av det experimentella protokollet. Förbehandling av data utförs med hjälp av anpassade skriftliga skript i MATLAB. Sammantaget är detta experimentella paradigm in vivo redo att ge en bättre förståelse för sensorisk feedback under rörelse i ett modell ryggradsdjur hårcellssystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det experimentella protokollet som beskrivs ger potential att övervaka endogena förändringar i sensorisk ingång över motoriska beteenden i ett intakt, beter sig ryggradsdjur. Specifikt beskriver det en in vivo-metod för att utföra samtidiga extracellulära inspelningar av laterala linje afferenta nervceller och ventrala motoriska rötter i larv zebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidigare karakteriserats i zebrafisk utan hänsyn till potentiell samtidig motoriskaktivitet 1,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt stöd från National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) och Whitney Laboratory for Marine Biosciences till J.C.L. Vi vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i Liao Lab för att de stimulerat till diskussioner.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish’s lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell’s afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat’s auditory nerve. , (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator’s strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal’s own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
