Gonfiaggio dell'aria dei polmoni murini con perfusione-fissazione vascolare
Summary
Viene presentato un metodo per il gonfiaggio dell’aria con perfusione-fissazione vascolare dei polmoni che preserva la posizione delle cellule all’interno delle vie aeree, degli alveoli e dell’interstizio per le analisi struttura-funzione. La pressione costante delle vie aeree viene mantenuta con una camera di gonfiaggio dell’aria mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro. I polmoni vengono elaborati per studi istologici.
Abstract
L’istologia polmonare viene spesso utilizzata per studiare i contributi forniti dalle cellule dello spazio aereo durante l’omeostasi polmonare e la patogenesi della malattia. Tuttavia, i metodi di fissazione basati sull’instillazione comunemente usati possono spostare le cellule dello spazio aereo e il muco nelle vie aeree terminali e possono alterare la morfologia dei tessuti. In confronto, le tecniche di perfusione-fissazione vascolare sono superiori nel preservare la posizione e la morfologia delle cellule all’interno degli spazi aerei e del rivestimento della mucosa. Tuttavia, se la pressione positiva delle vie aeree non viene applicata contemporaneamente, le regioni dei polmoni possono collassare e i capillari possono gonfiarsi negli spazi alveolari, portando alla distorsione dell’anatomia polmonare. Qui, descriviamo un metodo economico per l’inflazione dell’aria durante la perfusione-fissazione vascolare per preservare la morfologia e la posizione delle vie aeree e delle cellule alveolari e dell’interstizio nei polmoni murini per gli studi istologici a valle. La pressione costante dell’aria viene erogata ai polmoni attraverso la trachea da una camera sigillata e riempita d’aria che mantiene la pressione attraverso una colonna liquida regolabile mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro.
Introduction
L’istologia polmonare rappresenta il gold standard per la valutazione dell’architettura polmonare durante la salute e la malattia ed è uno degli strumenti più comunemente usati dai ricercatori polmonari1. Uno degli aspetti più critici di questa tecnica è il corretto isolamento e conservazione del tessuto polmonare, poiché la variabilità in questa fase può portare a una scarsa qualità dei tessuti e risultatierrati 1,2,3. Negli animali viventi, il volume polmonare è determinato dall’equilibrio tra il rinculo elastico verso l’interno del polmone e le forze esterne trasmesse dalla parete toracica e dal diaframma dalla tensione superficiale. Di conseguenza, quando si entra nel torace, le forze esterne vengono perse e il polmone collassa. Le sezioni istologiche preparate da polmoni collassati hanno un aspetto affollato e i confini tra i compartimenti anatomici (cioè spazi aerei, vascolarizzazione e interstizio) possono essere difficili da distinguere. Per aggirare questa sfida, i ricercatori spesso gonfiano i polmoni durante la fissazione chimica in modo da mantenere le dimensioni e l’architettura dello spazio aereo.
I polmoni possono essere gonfiati con aria o liquido. La pressione necessaria per gonfiare i polmoni allo stesso volume differisce tra gonfiaggio dell’aria e del liquido a causa delle forze intermolecolari all’interfaccia aria-liquido. Durante il gonfiaggio dell’aria è necessaria una pressione più elevata (ad esempio,25cmH 2 O) rispetto al gonfiaggio del liquido (ad esempio, 12 cmH2O) per superare la tensione superficiale e aprire gli alveoli collassati4. Una volta che gli alveoli sono stati reclutati, una pressione inferiore può mantenere gli alveoli aperti allo stesso volume dei plateau della curva pressione-volume, e le pressioni si equalizzano in tutto il polmone secondo la legge di Pascal4,5,6,7,8.
Esistono due metodi principali di inflazione e fissazione polmonare per preservare i polmoni murini per l’istologia. Più comunemente, gli spazi aerei sono instillati con liquido – spesso contenente un fissativo. Il vantaggio principale di questo approccio è che è relativamente facile e richiede poca formazione. Mentre l’instillazione intratracheale di fissativo può essere preferita negli studi che si concentrano sulla vascolarizzazione, il liquido che viene instillato attraverso la trachea tende a spingere le cellule prossimali delle vie aeree e le mucina in regioni più distali dello spazio aereo mentre l’inflazione dell’aria non1,3,4,9,10,11. Inoltre, il distacco involontario dei leucociti dall’epitelio durante il gonfiaggio liquido altera la loro morfologia, conferendo loro un aspetto semplice e arrotondato4,10,11,12. Infine, il gonfiaggio dei polmoni con liquido può involontariamente comprimere l’interstizio4,10,11. Insieme, questi fattori possono distorcere la normale anatomia e le distribuzioni cellulari all’interno dei polmoni conservati, limitando così la tecnica.
Un metodo alternativo di conservazione dei tessuti è la perfusione-fissazione vascolare. In questo metodo, il fissativo viene perfuso nella vascolarizzazione polmonare attraverso la vena cava o il ventricolo destro. Questo metodo preserva la posizione e la morfologia delle cellule nel lume dello spazio aereo. Tuttavia, a meno che i polmoni non siano gonfiati durante la fissazione della perfusione, è probabile che il tessuto polmonare collassi.
Il gonfiaggio dell’aria con perfusione-fissazione vascolare sfrutta i punti di forza di ciascuna delle tecniche di fissazione di cui sopra. Qui forniamo un protocollo per questa tecnica. I materiali e le attrezzature necessari sono relativamente economici e possono essere facilmente ottenuti e assemblati. La configurazione completata, mostrata nella Figura 1A,fornisce una pressione costante delle vie aeree ai polmoni attraverso una colonna regolabile e piena di liquido, mentre una pompa peristaltica fornisce fissativo attraverso il ventricolo destro. I polmoni con morfologia preservata possono quindi essere ulteriormente elaborati per analisi struttura-funzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene comunemente usati, i metodi di fissazione intratracheali spostano i leucociti dalle vie aeree e possono alterare la normale architettura polmonare. Il metodo di gonfiaggio dell’aria con fissazione della perfusione vascolare fornito in questo protocollo supera queste insidie e preserva più accuratamente l’anatomia polmonare. Le chiavi per ottenere tessuto di alta qualità dal metodo di perfusione-fissazione vascolare includono un attento monitoraggio delle pressioni di gonfiaggio dell’aria, evitando perdite d’ari…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) sovvenzioni HL140039 e HL130938. Gli autori desiderano ringraziare Shannon Hott e Jazalle McClendon per la loro competenza tecnica.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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