Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation
Summary
Présenté est une méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation des poumons qui préserve l’emplacement des cellules dans les voies respiratoires, les alvéoles et l’interstitium pour les analyses structure-fonction. La pression constante des voies respiratoires est maintenue avec une chambre de gonflage de l’air tandis que le fixateur est perfusé via le ventricule droit. Les poumons sont traités pour des études histologiques.
Abstract
L’histologie pulmonaire est souvent utilisée pour étudier les contributions fournies par les cellules de l’espace aérien au cours de l’homéostasie pulmonaire et de la pathogenèse de la maladie. Cependant, les méthodes de fixation basées sur l’instillation couramment utilisées peuvent déplacer les cellules de l’espace aérien et le mucus dans les voies respiratoires terminales et peuvent modifier la morphologie des tissus. En comparaison, les techniques de perfusion-fixation vasculaire sont supérieures pour préserver l’emplacement et la morphologie des cellules dans les espaces aériens et la muqueuse. Cependant, si la pression positive des voies respiratoires n’est pas appliquée simultanément, des régions des poumons peuvent s’effondrer et les capillaires peuvent gonfler dans les espaces alvéolaires, entraînant une distorsion de l’anatomie pulmonaire. Ici, nous décrivons une méthode peu coûteuse de gonflage de l’air pendant la perfusion vasculaire-fixation afin de préserver la morphologie et l’emplacement des cellules alvéolaires et de l’interstitium dans les poumons murins pour les études histologiques en aval. Une pression d’air constante est délivrée aux poumons via la trachée à partir d’une chambre scellée remplie d’air qui maintient la pression via une colonne de liquide réglable tandis que le fixateur est perfusé à travers le ventricule droit.
Introduction
L’histologie pulmonaire représente l’étalon-or pour évaluer l’architecture pulmonaire pendant la santé et la maladie et est l’un des outils les plus couramment utilisés par les chercheurs enpneumologie 1. L’un des aspects les plus critiques de cette technique est l’isolement et la préservation appropriés du tissu pulmonaire, car la variabilité de cette étape peut entraîner une mauvaise qualité des tissus et des résultats erronés1,2,3. Chez les animaux vivants, le volume pulmonaire est déterminé par l’équilibre entre le recul élastique vers l’intérieur du poumon et les forces extérieures transmises par la paroi thoracique et le diaphragme par la tension superficielle. En conséquence, lorsque le thorax est entré, les forces extérieures sont perdues et le poumon s’effondre. Les sections histologiques préparées à partir de poumons effondrés ont une apparence encombrée et les limites entre les compartiments anatomiques (c.-à-d. les espaces aériens, les vascularisations et l’interstitium) peuvent être difficiles à distinguer. Pour contourner ce défi, les chercheurs gonflent souvent les poumons pendant la fixation chimique afin de maintenir la taille et l’architecture de l’espace aérien.
Les poumons peuvent être gonflés avec de l’air ou du liquide. La pression nécessaire pour gonfler les poumons au même volume diffère entre le gonflage de l’air et celui du liquide en raison des forces intermoléculaires à l’interface air-liquide. Une pression plus élevée (p. ex., 25 cmH2O) est nécessaire pendant le gonflage à l’air que le gonflage liquide (p. ex., 12 cmH2O) pour surmonter la tension superficielle et ouvrir les alvéoles effondrées4. Une fois les alvéoles recrutées, une pression plus faible peut maintenir les alvéoles ouvertes au même volume que les plateaux de la courbe pression-volume, et les pressions s’égalisent dans tout le poumon selon la loi de Pascal4,5,6,7,8.
Deux méthodes principales d’inflation et de fixation pulmonaires existent pour préserver les poumons murins pour l’histologie. Le plus souvent, les espaces aériens sont instillés avec du liquide – contenant souvent un fixateur. Le principal avantage de cette approche est qu’elle est relativement facile et nécessite peu de formation. Alors que l’instillation intratrachéale de fixateur peut être préférée dans les études qui se concentrent sur le système vasculaire, le liquide qui est instillé par la trachée a tendance à pousser les cellules des voies respiratoires proximales et les mucines dans des régions d’espace aérien plus distales tandis que l’inflation de l’air n’a pas1,3,4,9,10,11. De plus, le détachement accidentel des leucocytes de l’épithélium lors de l’inflation liquide modifie leur morphologie, leur donnant de manière artéfactuelle un aspect simple et arrondi4,10,11,12. Enfin, le gonflage des poumons avec du liquide peut involontairement comprimer l’interstitium4,10,11. Ensemble, ces facteurs peuvent déformer l’anatomie normale et les distributions cellulaires dans les poumons préservés, limitant ainsi la technique.
Une autre méthode de préservation des tissus est la perfusion vasculaire-fixation. Dans cette méthode, le fixateur est perfusé dans le système vasculaire pulmonaire via la veine cave ou le ventricule droit. Cette méthode préserve l’emplacement et la morphologie des cellules dans la lumière de l’espace aérien. Cependant, à moins que les poumons ne soient gonflés pendant la perfusion-fixation, le tissu pulmonaire est susceptible de s’effondrer.
Le gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation exploite les forces de chacune des techniques de fixation ci-dessus. Ici, nous fournissons un protocole pour cette technique. Les matériaux et l’équipement requis sont relativement peu coûteux et peuvent être facilement obtenus et assemblés. La configuration terminée, illustrée à la figure 1A,fournit une pression constante des voies respiratoires aux poumons au moyen d’une colonne réglable remplie de liquide tandis qu’une pompe péristaltique fournit un fixateur via le ventricule droit. Les poumons à morphologie préservée peuvent ensuite être traités pour des analyses structure-fonction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que couramment utilisées, les méthodes de fixation intratrachéales déplacent les leucocytes des voies respiratoires et peuvent modifier l’architecture pulmonaire normale. La méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation qui est fournie dans ce protocole surmonte ces pièges et préserve plus précisément l’anatomie pulmonaire. Les clés pour obtenir des tissus de haute qualité à partir de la méthode de perfusion-fixation vasculaire comprennent une surveillance attentive des pressions…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les subventions HL140039 et HL130938 du National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI). Les auteurs tiennent à remercier Shannon Hott et Jazalle McClendon pour leur expertise technique.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
