血管灌流固定を用いたマウス肺の空気膨張
Summary
この発表は、気道、肺胞、インタースティジウム内の細胞の位置を維持し、構造機能解析用の肺の血管灌流固定を用いた空気膨張の方法である。固定剤は右心室を介して浸透している間一定の気道圧力は空気膨張部屋と維持される。肺は組織学的研究のために処理される。
Abstract
肺の病態は、肺の恒常性および病態の病態の間に空域細胞が提供する寄与を調査するためにしばしば使用される。しかし、一般的に使用される点熱ベースの固定方法は、空域細胞および粘液を末端気道に置き換えることができ、組織形態を変える可能性がある。それに比べて、血管灌流固定技術は、空域および粘膜内の細胞の位置および形態を維持する上で優れている。しかし、気道の正気圧が同時に加えなければ、肺の領域が崩壊し、毛細血管が歯槽の空間に膨らみ、肺の解剖学的歪みにつながる。ここでは、下流の組織学的研究のために、気道および肺胞細胞および間質の形態および位置を維持するための血管灌流固定中の空気膨張のための安価な方法を説明する。固定性が右心室を通して浸透している間、固定性は調節可能な液体コラムを介して圧力を維持する密封された空気満たされた部屋からの気管を介して一定の空気圧力が肺に渡される。
Introduction
肺の構造学は、健康と病気の間に肺アーキテクチャを評価するためのゴールドスタンダードを表し、肺の研究者によって最も一般的に使用されるツールの1です。この技術の最も重要な側面の1つは、肺組織の適切な単離と保存であり、このステップのばらつきは組織の質が悪く、誤った結果1、2、3につながる可能性がある。生きている動物では、肺容積は、肺の内向き弾性反動と、胸壁から伝わる外向きの力と表面張力による横隔膜とのバランスによって決定される。したがって、胸郭が入ると、外向きの力が失われ、肺が崩壊する。崩壊した肺から作製された組織学的部分は、混雑した外観を有し、解剖区画(すなわち、空域、血管系、および間質)の間の境界を区別することは困難であり得る。この課題を回避するために、研究者はしばしば化学固定中に肺を膨らませ、空域の大きさと建築を維持します。
肺は空気または液体で膨らませることができます。肺を同じ体積に膨らませるために必要な圧力は、空気と液体の界面での分子間力によって空気と液体の膨張の間で異なります。表面張力を克服し、崩壊した胞壁4を開くために、液体インフレ(例えば、12cmH2O)よりも空気膨張時に高い圧力(例えば、25cmH2O)が必要である。肺胞が募集されると、低圧は肺胞を圧力体積曲線台と同じ体積に開いたままにし、パスカルの法則4、5、6、7、8に従って肺全体に圧力が均等化する。
肺の膨張と固定の2つの主要な方法は、血液学のためにマウスの肺を保存するために存在する。最も一般的には、空域は液体を植え付け、しばしば固定剤を含む。このアプローチの主な利点は、比較的簡単で、トレーニングをほとんど必要としなくて済む点です。固定液の気管内点眼は血管系に焦点を当てた研究で好ましいかもしれないが、気管を介して植え付けられた液体は、空気インフレ率が1、3、4、9、10、11ではない間、近位気道細胞およびムチンをより遠位の空域に押し込む傾向がある。さらに、液体インフレ時に上皮から白血球を不注意に剥離すると形態が変化し、実際にそれらに単純で丸みを帯びた外観4、10、11、12を与える。最後に、液体を用いた肺の膨張は、意図せずにインタースティジウム4、10、11を圧縮する可能性がある。これらの要因は、一緒に保存された肺内の正常な解剖学および細胞分布を歪め、したがって技術を制限する。
組織保存の別の方法は、血管灌流固定である。この方法では、固定剤は、静脈または右心室を介して肺血管系に浸透する。この方法は、空腔内のセルの位置と形態を保持します。しかし、灌流固定中に肺が膨張しない限り、肺組織は崩壊する可能性が高い。
血管灌流固定を伴う空気膨張は、上記の各固定技術の強みを利用します。ここでは、この技術のプロトコルを提供する。必要な材料や機器は比較的安価で、簡単に入手して組み立てることができます。 図1Aに示す完成したセットアップは、調節可能な流体充填カラムを介して肺に一定の気道圧力を提供し、蠕動ポンプは右心室を介して固定性を提供します。保存された形態を有する肺は、構造機能解析のためにさらに処理することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般的に使用されているが、気管内ベースの固定法は、気道から白血球を置き換え、正常な肺アーキテクチャを変更することができます。このプロトコルで提供されている血管灌流固定による空気インフレの方法は、これらの落とし穴を克服し、より正確に肺の解剖学を保存します。血管灌流固定法から高品質の組織を得るための鍵は、空気膨張圧の注意深い監視、空気漏れの回避、および?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立心臓、肺、血液研究所(NHLBI)がHL140039とHL130938を助成金によって資金提供されました。著者たちは、シャノン・ホットとジャザレ・マクレンドンの技術的専門知識に感謝したいと考えています。
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
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