تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة
Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكول لتسمية الأيض من الخميرة مع 14حمض الخليك C، الذي يقترن كروماتوغرافيا طبقة رقيقة لفصل الدهون محايدة.
Abstract
الدهون المحايدة (NLs) هي فئة من الجزيئات الحيوية الكارهة للماء والتهم التي تلعب أدوارا رئيسية في الطاقة وداء الدهون. يتم توليفها NLs دي نوفو من أسيتيل-CoA ومتواجدة في المقام الأول في eukaryotes في شكل الدهون الثلاثية (TGs) وستيرول-استر (SEs). يتم الحفاظ على الإنزيمات المسؤولة عن تركيب NLs للغاية من Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) للبشر ، مما يجعل الخميرة كائنا نموذجيا مفيدا لتشريح وظيفة وتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL. في حين يعرف الكثير عن كيفية تحويل أسيتيل-CoA إلى مجموعة متنوعة من أنواع NL، لا يزال يتم اكتشاف آليات لتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL، وكيف يمكن أن يسهم سوء التنظيم في الأمراض الخلوية. وقد تم تطوير العديد من الطرق لعزل وتوصيف أنواع الأنواع NL واستخدامها على مدى عقود من البحث؛ ومع ذلك، لم يناقش بروتوكول كمي وبسيط لتوصيف شامل لأنواع الكائنات الرئيسية في النواة. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة وقابلة للتكيف لتحديد تركيب دي نوفو من الأنواع الرئيسية NL في الخميرة. نحن نطبق 14C-ace حمض الوسم الأيضي إلى جانب طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا لفصل وقياس مجموعة متنوعة من NLs الهامة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة لدراسة في معدلات رد فعل الجسم الحي من الإنزيمات NL أو تدهور الأنواع NL مع مرور الوقت.
Introduction
أسيتيل-CoA هو لبنة أساسية من الجزيئات الحيوية المتنوعة بما في ذلك الدهون المحايدة (NLs)، والتي هي بمثابة عملة الجزيئية الحيوية تنوعا لبناء الأغشية، وتوليد ATP، وتنظيم الإشارات الخلية1،2. وينظم تخزينها جزئيا توافر ال NLs لتحويلها إلى أي من هذه المسارات المعنية. قطرات الدهون (LDs)، العضيات السيتوبلازمية تتكون من النوى الكارهة للماء من الدهون الثلاثية (TGs) واستر الستيرول (SEs)، هي مقصورات التخزين الرئيسية لمعظم NLs الخلوية. على هذا النحو، LDs عزل وتنظيم NLs، والتي يمكن أن تتحلل وتستخدم في وقت لاحق للعمليات الكيميائية الحيوية والتمثيل الغذائي3،4. ومن المعروف أن سوء تنظيم NL والبروتينات المرتبطة LD يرتبط مع بداية الأمراض بما في ذلك ضمور الدهون ومتلازمات التمثيل الغذائي5،6. وبسبب هذا، تركز أبحاث LD الحالية بشكل مكثف على كيفية تنظيم توليف NL مكانيا وزمانيا وعبر أنسجة متميزة من الكائنات الحية متعددة الخلايا. نظرا للأدوار الخلوية في كل مكان لNLs، يتم الحفاظ على العديد من الإنزيمات المسؤولة عن توليف وتنظيم NLs في جميع أنحاء eukaryotes7. في الواقع ، حتى بعض prokaryotes مخزن NLs في LDs8. لذلك ، كانت الكائنات الحية النموذجية القابلة للسحب وراثيا مثل Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة) مفيدة لدراسة توليف NL وتنظيمها.
يمكن فصل وتكميم NLs من مستخلصات الخلايا بطرق لا تعد ولا تحصى ، بما في ذلك قياس الطيف اللوني الكتلي للغاز (GC-MS) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وقياس الطيف الكتلي السائل فائق الأداء (UPLC-MS)9و10و11. ولعل أبسط طريقة لفصل NLs هو عن طريق طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC)، والذي يسمح للقياس الكمي الكثافة اللاحقة من منحنى قياسي12،13. على الرغم من أن TLC يوفر فقط فصل مسار الحبيبات من NLs، فإنه لا يزال تقنية قوية لأنها غير مكلفة، وأنه يسمح لفصل سريع من NLs من عدة عينات في وقت واحد. اثنين من أكبر التحديات التي تواجه دراسة NLs عبر TLC هي: 1) مجموعة واسعة من وفرة الخلوية من الأنواع NL وسيطة لها، و 2) مجموعة من الميل المائي / hydrophobicity من وسيطة الدهون داخل مسارات توليف NL. وبالتالي، فإن التحديد الكمي لأنواع الأنواع من الكائنات البرية عبر TLC يقتصر عادة على أكثر الأنواع وفرة؛ ومع ذلك، يمكن إدخال 14C-خليك حمض شعري يعزز بشكل كبير الكشف عن وسيطة وفرة منخفضة داخل مسارات NL. يتم تحويل حمض الخليك بسرعة إلى أسيتيل-CoA بواسطة أسيتيل-CoA synthetase ACS214، مما يجعل 14حمض C-الخليك ركيزة مناسبة للتكبيل الإشعاعي في الخميرة15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق فصل كل من NLs الكارهة للماء والوسيطة المائية من NLs من قبل TLC من خلال استخدام أنظمة المذيبات المتعددة16. هنا، يتم تقديم طريقة لفصل NLs باستخدام 14C-ace حمض التمثيل الغذائي وضع العلامات في الخميرة. يتم عزل الدهون المسماة خلال فترة النبض في وقت لاحق من خلال بروتوكول عزل الدهون الكلي الراسخ17، يليه فصل أنواع NL بواسطة TLC. تطوير لوحات TLC من قبل كل من التصوير الشعاعي التلقائي لتصور الدهون المسماة ، ورذاذ كيميائي لتصور مجموع الدهون ، ويسمح لطرق متعددة للقياس الكمي. يمكن أيضا استخراج أشرطة الدهون الفردية بسهولة من لوحة TLC باستخدام شفرة حلاقة ، ويمكن استخدام عد التلألؤ لتحديد كمية المواد التي تحمل علامة إشعاعية داخل النطاق.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم تقديم بروتوكول تسمية إشعاعية متعددة لمراقبة كميا توليف الأنواع NL في الخميرة. هذا البروتوكول هو وحدات جدا، والذي يسمح لهذا الإجراء أن ينتهي في غضون 3-6 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، توجد ثروة من الأدب على استخدام TLC لفصل أنواع الدهون والأيض ، والتي يجب أن تسمح للمستخدم بالكشف عن العديد من …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر هين على المساعدة والمشورة المفاهيمية في إنجاز هذه الدراسة. W.M.H. مدعوم بأموال من مؤسسة ويلش (I-1873)، وNIGMS المعاهد القومية للصحة (GM119768)، وصندوق البحوث الطبية آرا Paresghian، وبرنامج العلماء الموهوبين جنوب غرب UT. تم دعم S.R بمنحة برنامج T32 (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
